鹰嘴豆低聚肽抗疲劳活性研究

贾前生 刘远洋 李 丹

(1. 黑龙江八一农垦大学体育教研部，黑龙江 大庆 163319；2. 黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319)

鹰嘴豆多肽是一种具有抗氧化、降血脂、提高免疫力等多种生理功能的生物活性多肽[1]。刘宇等[2]研究发现鹰嘴豆多肽具有较强的抗氧化能力，其超氧阴离子的清除率显著高于大豆蛋白水解物；Wen等[3]研究发现分子质量在1 000 Da的鹰嘴豆多肽可以显著降低高脂模型大鼠血清中的甘油三酯及血清胆固醇的含量；李睿珺等[4]研究发现鹰嘴豆多肽可能通过影响IL-17A、IL-2、IL-5、IL-9等细胞因子的分泌而提高小鼠的免疫力。

运动疲劳是一种因运动所引起的机体工作能力短时下降、能量供应不足的生理现象，代谢产物积累、氧化应激作用等都是运动中产生疲劳的重要因素[5]。植物蛋白活性肽比蛋白质更易于吸收利用，不仅能够给机体提供能量，还可以通过清除机体内代谢产物和自由基等途径起到抗运动疲劳作用[6-7]。鹰嘴豆中含有优质植物蛋白，其消化吸收比率以及生物利用率远高于其他豆类[8]。研究拟测定鹰嘴豆低聚肽的抗氧化活性，并研究鹰嘴豆低聚肽对小鼠负重游泳时间以及小鼠游泳后肌糖原和肝糖原含量、血尿素氮、乳酸、丙二醛等有害物质水平、抗氧化酶活性等指标的影响，以期为开发鹰嘴豆低聚肽抗疲劳产品提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性昆明小鼠：SPF级，体重18～22 g，北京维通利华公司；

Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶(2.0×105U/g)、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶(1.5×104U/g)：诺维信生物技术有限公司；

西洋参粉：吉林集安市春及参茸有限公司；

2，2'-偶氮二异丁基脒二盐酸盐(AAPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)： 美国Sigma公司；

乳酸试剂盒、尿素氮试剂盒、肌糖原试剂盒、肝糖原试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

单列数显恒温水浴锅：HH-6D型，上海左乐仪器有限公司；

电子天平：MF1035B型，济南童鑫生物科技有限公司；

分光光度计: V-1600B型，青岛明博环保科技有限公司；

高效液相色谱仪：CTO-20AC型，日本岛津公司；

高速冷冻离心机：fresco17型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

琼脂糖凝胶电泳仪：Power Pac型，美国Bio-Rad公司；

全波长酶标仪：Bio-Rad 680型，美国Bio-Rad公司；

Milli-Q超纯水仪：Direct-Q3型，美国Millipore公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鹰嘴豆低聚肽的制备 参照王雨晴等[9]的方法并略作修改。将400 g鹰嘴豆蛋白加入5 L去离子水中，搅拌均匀。料液(m酶∶m底物=1∶100)在50 ℃、pH 8.0条件下经碱性蛋白酶酶解3 h后，继续在50 ℃条件下利用中性蛋白酶酶解2 h(m酶∶m底物=1∶50)。料液于100 ℃ 水浴10 min灭酶，然后离心(3 000 r/min，15 min)取上清液。利用1 000 Da的超滤膜过滤上清液，得到相对分子质量低于1 000 Da的鹰嘴豆低聚肽溶液，溶液经浓缩、喷雾干燥后得到鹰嘴豆低聚肽粉末。

1.3.2 体外抗氧化活性的测定 参照Wu等[10]与Ahn等[11]的方法并略作修改。将等体积的待测液与DPPH溶液混合均匀，置于黑暗环境中30 min，在517 nm处测定吸光度(A1)。100 μL去离子水与100 μL DPPH溶液的混合溶液作为对照组并测定吸光度(A2)，同体积的乙醇溶液与去离子水的混合溶液作为空白组并测定吸光度(A0)。谷胱甘肽(GSH)作为阳性对照。按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

WDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A1——样品溶液在517 nm处的吸光度；

A2——对照组溶液在517 nm处的吸光度；

A0——空白组溶液在517 nm处的吸光度。

超氧阴离子自由基采用邻苯三酚自氧化法检测、羟自由基清除能力采用水杨酸法检测，还原力采用铁氰化钾法检测，计算各自的半抑制浓度(IC50)，进而表示鹰嘴豆低聚肽抗氧化功能。

1.3.3 动物试验条件及分组 将60只昆明种雄性小鼠随机分为5组即空白组，阳性对照组，鹰嘴豆低聚肽低、中、高剂量组，每组12只。经过1周明暗交替12 h的适应性饲养，自由采食饮水，室温为(22±2) ℃，相对湿度为(45±5)%。阳性对照组灌胃0.6 mg/(g·d)西洋参，低、中、高剂量鹰嘴豆低聚肽组分别灌胃0.5，2.0，3.5 mg/(g·d) 鹰嘴豆低聚肽，空白组连续4周灌胃等体积的蒸馏水。

1.3.4 力竭游泳试验 末次灌胃30 min后，将尾根部负重5%体重的铅丝小鼠置于深40 cm水箱中，待其鼻孔完全浸入水中7 s后，记录不能浮出水面的时间。

1.3.5 乳酸、尿素氮、肝糖原的测定 负重游泳的小鼠吹干后休息30 min，处死，取腿部腓肠肌和肝脏，生理盐水洗净，吸干，按照试剂盒检测方法检测小鼠肌糖原、肝糖原含量。

1.3.6 疲劳相关生化指标测定 末次灌胃30 min后，小鼠不负重在温水中游泳60 min，吹干后休息30 min，眼球取血，离心(3 000 r/min，10 min)制备清液，按照试剂盒说明书测定乳酸、尿素氮、CAT、SOD和GSH-Px的活力。

1.4 数据统计分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行独立样本t检验。结果用平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 鹰嘴豆低聚肽体外抗氧化活性

由表1可知，鹰嘴豆低聚肽DPPH自由基含量与阳性对照组无显著差异(P>0.05)，表明鹰嘴豆低聚肽具有一定的DPPH自由基清除能力。鹰嘴豆低聚肽对羟自由基的IC50值与阳性对照相比，二者无显著差异(P>0.05)，表明鹰嘴豆低聚肽具有一定羟自由基清除能力。鹰嘴豆低聚肽对超氧阴离子自由基的IC50值显著高于GSH阳性对照组(P<0.05)，表明鹰嘴豆低聚肽清除超氧阴离子自由基能力较弱。鹰嘴豆低聚肽的还原力显著高于GSH阳性对照组(P<0.05)。

表1 鹰嘴豆低聚肽体外抗氧化活性†

2.2 鹰嘴豆低聚肽对小鼠体重的影响

由表2可知：在饲养的第7、14、21、28天，鹰嘴豆低聚肽低、中、高剂量组的小鼠体重与空白组、阳性对照组的均无显著差异(P>0.05)。在饲养期间，小鼠体重未发生过快或过慢的增长，随着饲喂时间的延长，小鼠体重随之增加，各组小鼠精神状态良好、行为特征未发现异常，表明鹰嘴豆低聚肽对小鼠正常生长无影响。

表2 鹰嘴豆低聚肽对小鼠体重的影响

2.3 鹰嘴豆低聚肽对小鼠力竭游泳时间的影响

由图1可知，与空白组相比，中、高剂量组的鹰嘴豆低聚肽均显著增加了小鼠负重力竭游泳时间(P<0.05)。高剂量组小鼠的力竭游泳时间与阳性对照组无显著差异(P>0.05)。Kovacs-Nolan等[12]研究发现大豆肽不仅可以降低肌肉衰减率，还可以提高肌肉运动能力。由此可知，中、高剂量的鹰嘴豆低聚肽可以提高小鼠的运动耐力，一定程度上缓解体力疲劳。

小写字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4 鹰嘴豆低聚肽对小鼠肌糖原和肝糖原含量的影响

人体进行亚强度有氧运动时，肌糖原作为主要供能物质，其含量与持续亚强度运动时间呈正相关，同时，肝糖原补充供能，维持血糖稳态。因此，糖原消耗量与疲劳程度紧密关联[13]。由表3可知，低、中、高剂量组小鼠的肌糖原和肝糖原含量均高于空白组(P<0.05)，但低于阳性对照组，与刘娜等[14]、张铁华等[15]研究结果一致。因此，鹰嘴豆低聚肽可以通过提高肌糖原和肝糖原含量为机体提供能量，从而使血糖稳定在正常水平。

表3 鹰嘴豆低聚肽对小鼠肌糖原和肝糖原的影响†

2.5 鹰嘴豆低聚肽对小鼠体内有害物质浓度的影响

丙二醛是机体内氧自由基的重要代谢物，反映机体潜在的抗氧化能力、脂质过氧化的速率以及组织过氧化损伤的程度[16]。运动缺氧导致心肌组织中产生大量自由基。自由基作用于细胞膜上的不饱和脂肪酸，使膜脂发生过氧化作用，导致心肌细胞损伤，形成脂质过氧化，因此，在疲劳状态下，丙二醛浓度升高[17]。由表4可知，相比于空白组，鹰嘴豆低聚肽低、中、高剂量组的丙二醛浓度显著降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性，表明鹰嘴豆低聚肽能够通过抑制体内脂质过氧化来发挥抗疲劳作用。

表4 鹰嘴豆低聚肽对小鼠体内有害物质的影响†

血液中的乳酸是机体发生糖代谢的必然产物。血乳酸的升高会导致肌肉组织和血液的pH值下降，引发对人体功能有害的生化和生理过程[18]。由表4可知，相比于空白组，中剂量组和高剂量组小鼠的血乳酸浓度均显著降低(P<0.05)。由此可知，中、高剂量的鹰嘴豆低聚肽能够通过降低小鼠体内乳酸的堆积来缓解机体疲劳。

当机体内糖含量无法满足运动供能的需求时，机体内的蛋白质就会参与供能反应[18]，经肝脏代谢后产生血尿素氮，其含量与运动疲劳程度呈正相关[19]。因此，血尿素氮可以有效衡量机体疲劳程度。由表4可知，相比于空白组，低、中和高剂量组小鼠的血尿素氮浓度均显著降低(P<0.05)。高剂量组小鼠的血尿素氮浓度显著低于阳性对照组的(P<0.05)。综上，鹰嘴豆低聚肽能够降低小鼠体内代谢废物的堆积从而缓解机体疲劳。

2.6 鹰嘴豆低聚肽对抗氧化酶活力的影响

CAT可将机体中过量的H2O2催化分解，以此保护细胞膜结构和功能完整，因此CAT常用来评价机体抗氧化能力。由图2可知，相比于空白组，鹰嘴豆低聚肽低、中、高剂量组的CAT活力分别提高了4.80%，22.65%，45.53%。高剂量组CAT酶活与阳性对照组的无显著差异(P>0.05)。

SOD是一种能够清除代谢过程中有害物质的活性蛋白酶，其含量可以直接反映机体的疲劳程度[16]。由图2可知，相比于空白组，鹰嘴豆低聚肽低、中、高剂量组的SOD活力分别提高了2.07%，14.77%，19.22%，中、高剂量组小鼠肝脏SOD活力显著增高(P<0.05)。中剂量组SOD酶活与阳性对照组的无显著性差异(P>0.05)。

GSH-Px是人体最重要的过氧化物酶之一，可将体内H2O2还原为无毒的羟基化合物，维持细胞膜结构与功能[20]。运动使身体产生强烈的脂质氧化和葡萄糖代谢等氧化反应[21-22]。由图2可知，相比于空白组，鹰嘴豆低聚肽低、中、高剂量组的GSH-Px活力分别提高了4.60%，14.44%，24.84%，中、高剂量组小鼠肝脏GSH-Px活力显著增高(P<0.05)。高剂量组GSH-Px酶活与阳性对照组的无显著差异(P>0.05)。研究结果表明，鹰嘴豆低聚肽可以提高机体抗氧化酶的活性，清除因运动而产生的自由基，进而缓解疲劳。

图2 鹰嘴豆低聚肽对小鼠抗氧化能力的影响

3 结论

利用双酶水解法制备鹰嘴豆低聚肽，测定其抗氧化活性及反映疲劳程度的生化指标。结果表明，鹰嘴豆低聚肽DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力以及还原力均高于谷胱甘肽(阳性对照)；羟自由基清除能力与谷胱甘肽(阳性对照)接近。此外，与空白组相比，不同剂量的鹰嘴豆低聚肽均提升了小鼠负重力竭游泳时间、小鼠的肌糖原、肝糖原含量以及小鼠肝脏SOD活力；并且丙二醛含量、血乳酸浓度、血尿素氮浓度均降低；鹰嘴豆低聚肽提高了抗氧化酶的活力。因此，鹰嘴豆低聚肽具有显著的抗疲劳作用。但鹰嘴豆低聚肽属混合肽，其肽段组成以及起到抗疲劳作用的肽结构尚不明确，下一步拟开展鹰嘴豆低聚肽分离纯化研究，明确具有抗疲劳作用的肽段组成，探讨其抗疲劳机理。