海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌质谱数据库的构建及验证*

陈如寿, 钟佳芳, 石挺丽, 吴吉芳, 王婧婧, 颜礼完

三亚中心医院(海南省第三人民医院) 1检验科， 2耳鼻喉科， 3医院感染管理科(海南三亚 572000)

目前，海南的类鼻疽患者越来越多[1]，类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia. pseudomallei, BP)感染所致肺部感染及其他部位的慢性感染极易漏诊，导致不能得到有效治疗，而医生能得到微生物室快速鉴定报告，患者就会得到快速诊断及精准治疗，还能给重症感染者争取最佳治愈机会和时间，并降低病死率、提高治愈率。而传统的生化鉴定方法耗时较长，鉴定准确率低，易出现错误鉴定结果[2]，常导致不能及时、快速准确鉴定。而细菌基因测序设备贵、操作复杂、成本高，用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术可以解决BP的快速鉴定，只要建立菌株标准化图谱，可实现快速鉴定[3]。但目前，国内使用的MALDI-TOF MS因缺乏BP鉴定数据库而未能应用于临床。因此，本研究针对BP难鉴定的问题，通过收集2019年1月至2020年12月临床分离株构建了适合海南本地区应用的海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌质谱鉴定数据库。

1 资料与方法

1.1 菌株来源 质谱仪校准使用的标准菌株大肠埃希菌(ATCC 8739)由法国生物梅里埃公司提供。建库及验证菌株：收集建库菌10株及验证菌30株[4]共40株BP，均分离自2019年1月至2020年12月住院患者标本(痰、脓性分泌物及血液等)。并经过生化仪器(VITEK-2 Compact)鉴定筛选，再将全部菌株送给金域检验公司经16S基因测序[4]确认，全部准确鉴定为BP。其他伯克霍尔德菌20株也同样经16S基因测序[4]确认。本研究课题(论文)已获得三亚中心医院伦理委员会审批。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 哥伦比亚血平板及巧克力平板(广州迪景)。革兰阴性杆菌生化(GN)鉴定卡试剂盒、靶板、基质液(α-氰基-4羟基肉桂酸)均购自法国生物梅里埃公司。

1.2.2 仪器 VITEK-2 Compact，MALDI-TOF MS为法国生物梅里埃公司(VITEK MS v4.16)。16S基因测序分析仪器及试剂由金域检验公司检测提供。

1.3 方法

1.3.1 菌株保藏 建库及验证使用的BP，先使用菌株保存管于-80℃冰箱冻存，备用。

1.3.2 菌株鉴定 将临床收集得到40株BP，通过传统革兰染色、菌落形态特征、生化反应鉴定(VITEK-2 Compact)、16S rRNA基因测序确定至种水平。菌株测序送金域检验公司进行。全部菌株经准确鉴定为BP，性状稳定，符合建库要求。用于验证的其他伯克霍尔德菌20株：多噬伯克霍尔德菌(B.multivorans)13株、新洋葱伯克霍尔德菌(B.cenocepacia)4株、洋葱伯克霍尔德菌(B. cepacia)2株和唐菖蒲伯克霍尔德菌(B.gladioli)1株，经基因测序鉴定符合验证要求。

1.3.3 菌株前处理方法 将10株BP用血平板置35℃、24 h培养生长的菌苔，用接种环挑取纯的、单个的、适量菌苔，轻轻涂于靶板上。也可先将血平板35℃、24 h培养的大肠埃希菌(ATCC8739)涂于靶板质控孔当中。

1.3.4 菌株准备 建库使用菌株均采用新鲜培养24～48 h[4-5]的单个菌落。将10株BP先进行复苏，分别接种于2个血平板和2个巧克力平板上。将接种好的1个血平板置35℃恒温箱培养和1个巧克力平板置5% CO2、35℃恒温箱培养[4]；将1个血平板和1个巧克力平板置25℃培养恒温箱进行培养[4]。均培养24 h至肉眼可见菌落时，取出进行第1次涂靶板打点采集图谱[4]。次日，将上述培养至48 h的血平板和巧克力平板菌株又取出，再取菌苔进行第2次涂靶板、打点、采集图谱[4]。并将血平板35℃、24 h培养的大肠埃希菌涂于靶板质控孔当中用于质量控制[5]。验证使用菌株：用经血平板35℃、24 h培养得到的单个菌落，进行验证使用[4]。

1.3.5 靶板点样的准备 从培养基上挑取合适的菌量转移至靶板上相应靶点位置，用一次性接种环轻轻涂抹，使菌苔在靶点上形成一层均匀薄膜，覆盖靶点整个区域。先将大肠埃希菌涂点在靶板相应孔位，再进行其他菌株的涂点。涂点是要均匀，菌量适量。待涂点细菌自然晾干后，立即滴加1 μL基质液，再等待自然晾干。靶板点样准备完成，立即用VITEK MS进行上机检测[5]。将10株BP经35℃和25℃不同温度培养的血平板和巧克力平板的菌苔平行涂3个靶点[4]，共涂了120个靶点。次日，继续将以上培养48 h的平板菌苔，重复以上操作进行涂点，再次获得120个靶点。

1.3.6 谱图采集 涂好及加基质液的靶板，自然晾干后，及时上机检测。质谱仪器经自动校准合格后，自动采集图谱，设置激光照射次数为100次，相对分子量在2 000～20 000 Da。将涂好的每个靶点采集1遍；2次采集打点一共获得了240张合格的图谱。

1.3.7 建立超级图谱(SuperSpectrum)的筛选 按以下参数选择建立超级图谱：(1)菌种间重复(duplicates)质谱的相似性要>70.0%。(2)相同菌种质谱的相似性要>65.0%。(3)峰的数量(data count)要求在80～230之间，<80不能用于建立超级图谱。(4)相同质谱数量要求在50～70之间。将采集得到的240张图谱，按以上要求选择得到了高质量合格图谱109张，得到峰的数量为535个，可用于创建超级图谱。再选择菌株共有的峰(consensus spectra)即最特征性的峰：即每种质量峰至少80%的菌株都拥有，一般保留35～49个峰[4]。而本研究从535个不同质量的峰中经过选择，最终保留34个特征性峰，将特征峰与数据库中所有细菌质谱进行比较，其比较结果符合建库条件。

1.3.8 建立超级图谱(SuperSpectrum)库 创建超级图谱要符合2个条件：(1)特征峰的权重之和≤1 400。而本研究结果为1 394，满足该条件。(2)非建库菌(non-targeted speciec)匹配数权重之和≤600。而本研究结果为272，也符合该条件。所以，可保存采集的109张图谱生成超级图谱，并输入“hainanleibiju”英文名称并建立新的文件数据库，选择“伯克霍尔德菌”节点，并激活保存。

1.3.9 数据库鉴定验证 用30株经16S基因测序为BP的收集菌株及属内其他菌种20株[6]。用哥伦比亚血平板经35℃、24 h培养，取单个纯菌落进行涂靶，晾干后加1 μL基质液，再次晾干。使用VITEK MS采集图谱，用自建库和VITEK MS v4.16(RUO)库进行验证鉴定，记录鉴定结果和可信度(%)并进行比较。

1.4 统计学方法 由SPSS 17.0统计软件，率的比较采用2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自建数据库鉴定准确率的验证 结果显示，本自建库与VITEK MS v4.16(RUO)数据库鉴定结果比较，用于验证的30株BP自建库鉴定结果均为“hainanleibiju”(图谱见图1)，鉴定可信度为：29株99.9%、1株为98.6%；鉴定准确率为100.0%。VITEK MS v4.16(RUO)数据库鉴定结果的可信度： 16株为BP可信度在75.0%～87.5%之间，1株BP为95.0%，13株可信度为0.0%(无鉴定结果)；鉴定准确率为56.67%。结果为自建库鉴定准确率为100.0%(30/30)，高于VITEK MS v 4.16(RUO)数据库的56.67%(17/30)，差异有统计学意义(2=11.08，P<0.005)。见表1。

注：峰图的横坐标是指Mass(峰的质量大小)，检测范围是2 000～20 000 Da；纵坐标是指Intensity(峰的强度)，范围在0～100%之间。上述峰图可以得知存在2 697、4 366、4 451、4 769、5 612、6 316、7 274、9 067、9 230等质量峰

表1 自建库与VITEK MS v4.16数据库鉴定结果比较

2.2 同属菌种验证 用自建库进行属内菌种20株进行鉴定验证，菌株经VITEK MS与基因测序鉴定结果[6]一致相同。验证菌株为：多噬伯克霍尔德菌13株、新洋葱伯克霍尔德菌4株、洋葱伯克霍尔德菌2株和唐菖蒲伯克霍尔德菌1株。经自建库鉴定证实所有菌株鉴定结果均没有错误鉴定为“hainanleibiju”。本研究自建库可以用于准确鉴定“海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌”。

3 讨论

近年来，类鼻疽败血症在海南感染病例呈逐年上升趋势[1，7]，BP引起败血症急性感染在短时间内导致患者多脏器衰竭、休克和死亡，如不及时治疗导致病死率高达25.0%～70.0%[1，7]，已成为海南重要的人畜共患病原菌。其引起的感染表现为“多样性”，除了常见肺部感染和败血症，还引起：肝脓肿、关节炎、淋巴结炎、泌尿道感染、前胸壁脓肿[8]和腮腺炎[9]等。引起的急性重症或者慢性反复感染极易误诊和漏诊[7，9-10]，值得医生关注。BP感染不同部位治疗方案和用药周期又不同[8]，故微生物室能快速、准确鉴定BP，可帮助医生快速精准诊断和治疗，对降低重症病死率有重要临床意义。而MALDI-TOF MS是目前临床上能鉴定BP的最快速方法[3]。

本数据库基于VITEK MS设备构建，因国内MALDI-TOF MS仪器数据库不能鉴定BP，而类鼻疽病确是海南地区常见的严重感染性疾病，故需要增加符合区域特点的菌种数据库。

临床菌株验证发现，本研究自建库与VITEK MS v4.16(RUO)数据库鉴定结果比较，自建库鉴定准确率100%明显比VITEK MS v4.16(RUO)数据库准确率56.67%要高。使用10株本地区临床相关模式菌株基于MALDI-TOF MS建立了海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌数据库并用30株临床模式株BP及20株属内菌株进行验证。结果显示，均能将这30株菌准确鉴定为“hainanleibiju”；也不会将属内的菌种鉴定为“hainanleibiju”。本次研究没有把鼻疽伯克霍尔德菌(B.mallei)加入海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌超级图谱中比较，主要考虑为鼻疽伯克霍尔德菌引起的临床感染更为罕见，并且临床意义有限。本研究显示，自建库能准确鉴定海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌，说明本自建库质量达到较高水平。

本自建库对BP鉴定可信度较高为99.9%，而VITEK MS v4.16(RUO)数据库鉴定可信度偏低，只有1株可信度较高为95.0%，16株可信度偏低在75.0%～87.5%之间，有13株不能鉴定出来。这可能与自建库使用的菌株均为海南地区临床感染致病性模式株有关，当地BP的蛋白图谱特征峰表达更加明显和接近，更有利于蛋白图谱结果比对。本自建数据库针对海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌鉴定，具有良好的临床应用前景。同时也将需要更多的菌株量来验证和评价。

综上所述，本自建库能够准确区分海南病原类鼻疽伯克霍尔德菌，具有高特异度、高敏感度、操作简便、鉴定快速等一系列优点，能够快速报告给医生进行精准诊断及治疗，可降低感染病死率，符合在临床微生物实验室推广使用。

利益相关声明：本文所有作者声明无利益冲突。

作者贡献说明：研究设计和论文写作为陈如寿，研究方案执行与实施为钟佳芳和王婧婧，质谱仪菌株数据库的建库完成为陈如寿和王婧婧，数据统计分析及论文修改为钟佳芳和石挺丽，查文献和病例资料的整理为钟佳芳和吴吉芳。收集菌株和菌种的保存为颜礼完。