大豆开花期性状QTL定位和候选基因挖掘

刘薇，王玉斌，李伟，张礼凤，王彩洁，徐冉，戴海英，张彦威

（山东省农业科学院作物研究所/山东省特色作物工程实验室，山东 济南，250100）

大豆是典型的短日作物，对光周期极为敏感[1，2]。同一品种在不同纬度地区间引种时，常因日照长度的变化导致开花期提前或延后，造成产量下降甚至颗粒无收。因此，大豆存在单一品种适应性狭窄的特性，这一特性给大豆的远距离引种和高油高蛋白等优良品种的全国性推广带来巨大困难。关注大豆开花位点及关键基因调控开花的分子机制，对培育广适性大豆品种具有重要的指导意义。

QTL定位方法的发展促进了大豆开花等数量性状相关位点的发掘。截至目前，大豆的开花期主效位点E1～E11，J和Tof11，Tof12相继被发现[3]。其中E系列基因中的E1～E4与大豆品种的生态适应性密切相关。E1编码豆科植物特有的转录因子，对开花期及生育期的影响最为突出。该基因在长日条件下诱导表达，是重要的开花抑制基因[4]。E2基因是拟南芥GIGANTEA（GI）的同源基因GmGIɑ[5]，E3，E4基因分别为大豆光敏色素A基因GmPHYA3[6]和Gm-PHYA2[7]，二者协同调控E1的表达。E1，E2，E3和E4在长日条件下通过下调开花促进基因GmFT2ɑ和GmFT5ɑ的表达而延迟大豆的开花和成熟[4,5,8]。E1-E4基因型的组合虽然与大豆品种的生态适应性密切相关[9]，但研究发现，在E1～E4基因型相同的群体中仍存在开花成熟时间差异较大的现象，说明可能还存在其它影响开花期和成熟期的基因[10]。

本研究利用滑皮豆和齐黄26 构建的重组自交系群体，对其F8:9和F8:10进行2年的开花期数据统计，结合前期利用SLAF测序获得的高密度遗传图谱[11]，对开花期性状进行了QTL 定位分析，并筛选出了4个开花期调控的候选基因。研究结果将为理解大豆开花和适应性机制提供理论基础，为大豆广适育种提供新的基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用材料为滑皮豆和齐黄26 杂交构建的重组自交系群体（Recombinant Inbred Lines,RILs），该群体含有149 个家系。前期基因组测序结果显示[11]，母本滑皮豆与父本齐黄26 生育期基因E1～E4的基因型相同，均为E1e2ɑsE3-HɑE4。

1.2 方法

1.2.1 开花期的统计 将RIL 群体F8:9和F8:10代分别于2013 年和2014 年6 月种植在山东省农业科学院济南试验地。每个家系种一行，行长3 m，行距50 cm,株距10 cm，3 次重复。约50%的植株开花时的日期记为初花期。

1.2.2 QTL分析 采用分析软件SPSS对群体2013年和2014 年开花期表型数据进行统计和分析。利用前期构建的高密度遗传图谱[11]，采用QTLICIMapingV4.2 软件中的ICIM-ADD 方法进行大豆开花期性状的QTL 分析。以似然函数比值对数值（logarithm of odds, LOD）＞2.5 为依据确定QTL。QTL 的命名方式为：q+FT+染色体编号+QTL编号。

1.2.3 候选基因预测 利用Soybase 数据库（https://www. soybase. org/sbt/）提取QTL 位点间的所有基因，以亲本基因组测序结果为依据，筛选出QTL 位点区间内且CDS 区在双亲间存在变异的基因。利用Soybase 中的Go enrichment 工具对基因进行GO分析；利用Uniprot 数据库（https://www.uniprot.org/）及基因对应的拟南芥同源基因的功能筛选出开花调控候选基因。

2 结果与分析

2.1 大豆RIL群体开花表型分析

亲本和RIL 群体在2013 和2014 年的开花表型分析结果见表1。结果表明，群体中的开花期存在一定的差异，其中2013年开花期在36～50 d之间，标准差为2.65，峰度为0.31，偏度为0.15；2014 年开花期在36～49 d 之间，标准差为2.90，峰度为-0.47，偏度为-0.07。开花期的峰度和偏度的绝对值均小于1（表1）。群体开花期数据分布近似正态分布（图1），适合进行QTL定位。

表1 亲本和群体开花期数据统计Table 1 Flowering time statistical analysis result of the parents and the population

图1 RIL群体两年开花期表型数据频率分布Fig.1 Frequency distribution of soybean flowering time in RIL population over 2 years

2.2 大豆开花期性状QTL定位及分析

利用ICIM-ADD 方法对大豆开花期性状进行QTL 定位。检测到11 个与开花时间相关的QTL（图2），分别位于6，8，11，14，16，19，20 这7 条染色体上（图2，表2）。所有QTL 的LOD 值在3.83～13.55 之间，表型贡献率在1.75%～8.25%之间。qFT6-1、qFT8、qFT11-1、qTF19、qFT20-1和qFT20-2在2013年和2014 年均被检测到，其中qFT6-1的表型贡献率最高，在2013 年和2014 年分别是8.25% 和7.13%，LOD 值分别是10.92 和13.55。6 个稳定QTL 位点中仅有qFT11-1的加性效应为负值，表现为负遗传效应，其它5个位点的加性效应均为正值，即表现为正遗传效应。另外，还检测到了5 个单一环境下的QTL 位点，即qFT6-2，qFT11-2，qFT11-3，qFT14和qFT16。通过Soybase 数据库分析发现，本研究检测到的所有位点中有7个与已报道的开花相关QTL 交叉重合，其它4 个QTL（qFT8、qFT20-2、qFT14和qFT16）是新的QTL（表2）。

表2 大豆开花期QTL定位结果Table 2 Details of QTLs associated with flowering time in soybean

图2 不同环境下开花期相关QTL位点Fig.2 QTL associating with flowering time detected under different environments

2.3 QTL区间内基因注释和候选基因的筛选

对6 个在两个环境中稳定存在的QTL 位点，包括4 个已经报道的QTL（qFT6-1，qFT11-1，qFT19和qFT20-1）以及2个新的QTL（qFT8和qFT20-2）进行候选基因的分析。6个QTL区间内共有121个基因。亲本基因组测序结果分析发现有53 个基因CDS 区在双亲间存在变异（表3）。GO 分析结果显示，这些基因主要参与生物过程和分子功能。生物过程涉及到花发育调控，如雄蕊发育、花瓣发育、胚珠发育以及防御反应等；分子功能涉及到转录因子活性，如蛋白激酶活性、蛋白磷酸化活性等（图3）。根据GO 分析结果，Uniprot 数据库注释信息以及拟南芥同源基因的功能分析，筛选出4 个开花期调控的候选基因（表4）。Glymɑ. 06g191800和Glymɑ. 20g153 600分别位于已报道的QTL（qFT6-1和qFT20-1）区间内。Glymɑ. 08g039800和Glymɑ. 20g154200分别位 于 新 的QTL（qFT8和qFT20-2）区 间 内。Glymɑ.06g191800编码一个bHLH 转录因子，是拟南芥开花促进基因PRE3（AT1G74500）[16]的同源基因。相比于父本齐黄26，母本滑皮豆中该基因第二个外显子区处增加了4 个碱基，导致移码突变。Glymɑ. 08g039800在滑皮豆中第563 个氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸，是拟南芥开花促进基因VRN5（AT3G24440）[17]的同源基因；Glymɑ.20g153600具有磷酸转移酶活性，在滑皮豆中第37个氨基酸由脯氨酸变成丝氨酸，第232 个氨基酸由缬氨酸变成苯丙氨酸，与拟南芥开花促进基因PGM1（AT5G51820）[18，19]同 源。Glymɑ. 20g154200是MADS-Box 家族转录因子，在母本滑皮豆中第2 个氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，第105 个氨基酸由天冬氨酸变为甘氨酸，是拟南芥开花促进基因AGL42（AT5G62165）[20]的同源基因。

表3 两个环境均检测到的QTL位点信息Table 3 Informationof QTLs identified in 2 years

表4 大豆开花期性状候选基因信息Table 4 Information of the candidate genes related to flowering time of soybean

图3 稳定QTL区间内基因GO分析Fig.3 GO annotation of genes in stable QTL interval

3 讨论

开花期是影响大豆生长、决定大豆适应性和产量的重要因素。生育期主效基因E1-E4基因型的组合与大豆品种的生态适应性密切相关[9]，但是，在这些生育期基因背景相同的群体中，仍存在开花成熟时间相差较大的现象[10]，说明可能还存在其它影响开花期的基因。通过滑皮豆和齐黄26 的基因组测序结果分析发现[11]，二者的E1-E4基因型相同，因此利用二者构建的RIL 群体进行开花期的QTL 定位，能够消除主效基因E1-E4的遗传效应，进而发现影响开花期的其它相关QTL位点。

本研究共发现了11 个QTL 位点，其中6 个QTL位点在两个环境中稳定存在，另外5 个QTL 位点仅在单一环境下存在，说明这些QTL 位点极易受到环境的影响。所有QTL 位点中，有7 个位点（qFT6-1、qFT11-1、qFT11-2、qFT11-3、qFT19、qFT6-2和qFT20-1）被前人报道。其中，qFT6-1位于First flower 26-2区间内[12]，qFT11-1位于Yamanaka 等定位的First flower 8-4的位点区间内[13]；qFT19位于Komatsu等定位的First flower 15-2位点的区间内[14]；qFT20-1与Khan 等定位到的开花位点First flower 16-3交叉重合[15]。这4个被报道的位点在本研究的两个环境中稳定存在，说明其受环境影响较小，是较为稳定的QTL。另外，本研究还鉴定到4 个新的QTL，其 中qFT8和qFT20-2在2013 年和2014 年的两个环境中均被检测到，可能是控制开花期重要的新位点。

基于QTL 定位结果，本研究对在两个环境中都存在的QTL 位点进行了候选基因的挖掘。通过亲本序列分析以及区间内基因的信息分析，筛选出4个可能参与开花期调控的候选基因。其中，Glymɑ. 06g191800和Glymɑ. 20g153600所在的QTL 位点（qFT6-1和qFT20-1）与前人报道的QTL 位点重合[12,15]。bHLH 是植物中的一个庞大的转录因子家族，拟南芥中该家族成员参与花期调控[21～23]。本研究中筛选的基因Glymɑ. 06g191800编码一个bHLH转录因子，是拟南芥PRE3的同源基因。拟南芥中研究发现，PRE1及其同源基因（PRE2,3,4,5）的过量表达会导致花期提前[16]。值得注意的是，Glymɑ.06g191800的CDS 区在母本滑皮豆中发生了移码突变，导致编码产物从第18个之后的氨基酸全部发生了变化。因此，Glymɑ. 06g191800可能是qFT6-1位点中的重要花期调控候选基因。在拟南芥的研究中发现，PGM1编码磷酸葡萄糖变位酶，能够促进叶片淀粉的合成，同时在短日条件下促进开花[18，19]。本研究中位于qFT20-1位点区间内的基因Glymɑ.20g153600是PGM1的同源基因，且在滑皮豆中发生了氨基酸的替换。拟南芥中，VRN5通过调节开花抑制基因FLOWERING LOCUS C（FLC）和FLOWERING LOCUS M（FLM）的表达促进开花[17]；MADS-box 家族基因AGL42通过赤霉素途径促进茎尖和腋生分生组织开花[20]。本研究中来自于新的QTL 位点（qFT8和qFT20-2）的2 个大豆开花调控候选基因Glymɑ.08g039800和Glymɑ.20g154200分别是上述拟南芥VRN5和AGL42的同源基因，且在母本滑皮豆中发生了氨基酸的替换，推测可能参与大豆的开花调控。后期需要对这些候选基因进行功能分析以阐明其功能和作用机制。

4 结论

本研究以滑皮豆和齐黄26 杂交衍生的高世代RIL 群体，利用前期构建的高密度遗传图谱，进行QTL 定位。共获得了11 个开花期相关QTL，其中4个未被报道。对QTL 区间内基因进行生物信息学分析，筛选出4 个与大豆开花期调控相关的候选基因，为大豆广适育种提供了一定的基因资源。