油菜F-box-LRR基因全基因组鉴定与核盘菌诱导应答分析

左蓉，吴姗，刘杰，胡鸣，程晓晖，刘越英，白泽涛，刘胜毅

（中国农业科学院油料作物研究所，农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北 武汉，430062）

油菜是我国重要的油料作物，菜籽油是我国主要的食用油，同时也是重要的饲料蛋白来源[1,2]。由核盘菌引起来的菌核病是油菜的主要病害之一，在全国范围内均有发生，长江流域每年发病最严重，常年损失约10%～20%，严重时可导致油菜减产80%，直接经济损失数亿元[3]。油菜从苗期到成熟期均能发病，油菜的叶片、茎秆、花瓣、角果等各个部位均能被核盘菌侵染，严重影响油菜的产量和质量[4,5]。综合考虑当前菌核病的防治策略，选育抗病品种是最为经济且安全有效的方法，而挖掘抗病基因是培育抗病品种的基础。多年的研究鉴定发现了多个参与调控植物菌核病抗性的基因，主要包括降解核盘菌细胞壁相关基因，如菜豆几丁质酶基因[6]、OsPGIP2[7]；次生代谢相关基因，如CsCCR4[8]；以及植物防御信号转导基因，如BnMPK4[9]等基因。尽管在植物菌核病抗性基因的功能研究方面取得了一定进展，但仍未在植物中发现调控菌核病抗性的主效基因，因此，非常有必要综合多种生物学手段进一步深入挖掘植物菌核病抗性功能基因。

F-box 基因家族在植物中分布极为广泛，其数目数以千计[10～12]。F-box基因在蛋白结构上常包含多个结构域，其中F-box 位于N 端，长度为40～60 个氨基酸，在物种间相对保守，而C端的结构域复杂多变，常见的有KELCH、FBA、FBD、LRR（富含亮氨酸重复序列）等[13,14]。F-box 结构域能够与26S 蛋白酶体系统（ubiquitin-26s proteasome system UPS）中泛素连接酶E3（ubiquitin protein ligases E3）的SCF 复合体（Skp1-Cul1-F-box-RBX1）中的Skp1 结合，介导蛋白降解[15]，而C 端的结构域往往能够与不同蛋白特异性互作。正是由于F-box基因C 端结构的多样性，该基因家族成员广泛参与了植物的多种功能，包括生长发育、开花、光信号传导、生物钟调节、激素信号转导，以及逆境胁迫等[10,16]。

植物与病原菌在长期共存中，进化出多重防御系统以抵抗病原菌入侵，其中激素是植物体内防御信号传递的重要使者[17～19]，而抗病基因能够直接或间接地与病原菌效应蛋白发生互作激发更强的植物免疫反应[20,21]，因此，二者在植物抗病系统中都具有关键性的作用。研究表明，F-box基因能够调控激素和抗病基因的蛋白丰度，从而影响植物抗病性[22,23]。多种激素受体中包含F-box 结构域，如拟南芥MAX2 蛋白是一个C 端包含LRR 结构域的F-box蛋白，研究发现AtMAX2参与植物的细菌病原性免疫反应[24]，mɑx2突变体中气孔开合度变大，从而使丁香假单胞菌和胡萝卜果胶菌更容易进入植物体内[24]，MAX2 通过关闭气孔，从而阻断细菌的侵入。TIR1/AFBs 生长素受体蛋白具有高度保守的F-box结构域和亮氨酸重复的结构域（LRR）[25,26]，miR393负调控TIR1、AFB1、AFB2、AFB3基因的表达，响应病原菌的侵染，过表达miR393导致TIR1水平下降，特异性提高了拟南芥对丁香假单胞杆菌的抗性[27,28]。拟南芥茉莉酸受体COI1的N端为F-box domain，C 端为18 个串联的LRRs domain[29]，其N 端Fbox 与Skp1、Rbx1 等相互结合，形成SCF-COI1 复合体即E3泛素连接酶，C 端LRR 特异识别转录抑制子JAZ，促进其通过26S 蛋白酶体途径降解，解除了JAZ 对茉莉素途径转录激活因子MYC2 的抑制作用，释放出MYC2，从而激活茉莉素信号途径下游信号防御通路[30～32]。由此可见，F-box-LRR基因在植物防御病原菌入侵方面具有重要作用。

全基因组水平鉴定植物中F-box-LRR基因亚家族能够从基因的全局水平了解该亚家族的数量规模，同时结合生物信息分析揭示其序列特征以及进化规律，可为后续进一步的功能研究提供理论基础和方向指导。在已完成测序的基因组中，重要农作物如水稻、大豆、玉米等分别含有678、509、359个F-box基因，其中F-box-LRR 亚族分为61、19、16个[16,33～35]。经济作物苹果、梨中分别含有517 和226个F-box基因，其中F-box-LRR 亚族分别为34 和3个[34,36]。数以百计的F-box基因存在于各种植物中，这使其成为植物最大的基因家族之一，然而还没有对F-box-LRR亚族进行单独分析。

油菜是我国重要的油料作物，菜籽油是我国主要的食用油，同时也是重要的饲料蛋白来源[2,37]。随着油菜基因组计划的持续推动，目前已获得了油菜不同品种（Darmor 和中双11）高质量的基因组序列，且油菜Pan基因组的公布更为研究者提供了多个参考基因组进行比较分析[38]。尽管F-box-LRR基因在植物抗病中的作用已初见端倪，但油菜中F-box-LRR的普遍性以及对其抗病性目前仍缺乏全面深入的探讨。

本研究拟从全基因组水平鉴定甘蓝型油菜中F-box-LRR基因及其家族成员，并借助生物信息学分析对其序列特征和进化分类进行详细分析，同时结合转录组以及分子实验初步探索BnF-box-LRR对油菜当前最重要的真菌性病害-菌核病的应答反应，以确定其对油菜菌核病的可能作用。该结果预期将揭示BnF-box-LRR的进化规律并为后续BnFbox-LRR的菌核病抗性研究提供基因源。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蓝型油菜中油821种子（抗菌核病品种，由本实验室保存），核盘菌菌株WH13，由本实验室在武汉大田中收集的菌核分离所得。

1.2 甘蓝型油菜BnF-box-LRR基因家族的鉴定

甘蓝型油菜（Brɑssicɑ nɑpusL.）的基因组序列，CDS 序列以及蛋白质序列及其注释信息均下载自BRAD 数据库（https://www. genoscope. cns. fr/brassicanapus/）。F-box 结构域pfam 种子序列PF0064 下载自Pfam 数据库（（http://pfam. xfam. org/）。利用HMMER3.0 检索甘蓝性油菜的全基因组蛋白序列，搜索E值设为1×10-5，获得甘蓝型油菜的F-box基因家族成员候选基因，用CDD（conserved domain database）软件[39]对这些候选基因进行保守结构域分析，筛选出C 端含有leucine rich repeat（LRR 结构域）的候选基因。最后将这些候选蛋白序列用在线工具Smart（http://smart.embl.de/）分析保守结构，以确认候选BnF-box-LRR基因中包含完整的F-box 以及LRR结构域。

1.3 BnF-box-LRR保守结构域及进化分析

Clustal W2[40]用于鉴定到的BnF-box-LRR 蛋白序列比对，仅保留N 端保守结构域，通过在线软件Web Logo3（https://weblogo. Threeplusone. com/）对BnF-box-LRR 蛋白进行N 端保守基序分析。MEGA[41]软件用于进化树分析，对161 个BnF-box-LRR 蛋白以及4 个功能明确的拟南芥AtF-box-LRR蛋白进行多序列比对，构建进化树，构建方法为邻近法（Neighbor-Joining，NJ），Bootstrap 值为1000。通过在线程序iTOL（https://itol. embl. de/）用于发育树的可视化。

1.4 BnF-box-LRR 基因结构以及蛋白保守基序（motif）分析

基因结构分析是将BnF-box-LRR的基因组序列以及注释信息从基因组文件中提取出来作为输入文件，输入到TBtools 软件完成基因结构的可视化[42]。利用在线软件MEME（http://meme-suite. org/tools/meme）对鉴定到的BnF-box-LRR 蛋白序列进行保守基序分析，设置为20 个motif，motif 在每一个序列上出现的次数不限，其它参数为缺省值，获得该基因家族的保守motif。

1.5 BnF-box-LRR基因组织表达分析

甘蓝型油菜中双11 的不同组织的表达数据来自实验室已发表文章[43]，基于其对油菜根、茎、叶、花、角果等5个组织的转录组数据，本研究提取了其中的BnF-box-LRR基因表达数据。各基因片段表达量的计算采用FPKM（fragments per kilobase million）法，将数据标准化后，并利用Mev 软件[44]完成其组织表达模式的热图可视化展示。

1.6 BnF-box-LRR 基因响应核盘菌诱导的应答分析

用中油821（抗病品种）和Westar（感病品种）[45]两个油菜品种（5 叶期接种核盘菌前后的叶片）的转录组数据[46]。以接种核盘菌0 h 和24 h 两个时间点的中油821 为材料，选取接菌前后明显上、下调表达的BnF-box-LRR基因，进行实时荧光定量PCR验证。在温室中种植中油821，长到5 叶期搬到接种室（22℃）黑暗处理24 h，随后将在PDA 培养基上活化的核盘菌菌丝用打孔器打孔，菌丝块朝下接种在油菜的叶片上，每株油菜接种3 个叶片，黑暗保湿，每隔12 h 取接种后的叶片（各取3 个份），用液氮速冻，保存于-80℃冰箱。在0、12、24 和48 h 分别取样，采用Trizol 法提取RNA，各样品RNA 采用TaKaRa 逆转录试剂盒反转录为cDNA（https://www.takarabiomed. com. cn），甘蓝型油菜荧光定量引物见表1，以油菜持家基因β-ACTIN（AF111812）作为荧光定量实验的内参基因。参照Bio-Rad 公司提供的试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应体系。所用仪器为伯乐CFX connect 实时荧光定量PCR 仪，用2-△△CT方计算相对表达量[47]，每次实验设置3 个技术重复。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

2 结果与分析

2.1 BnF-box-LRR基因家族的鉴定

通过HMEER3.0 检索在甘蓝型油菜中初步获得了1767 个含有F-box 结构域的候选基因，进而筛选C 端具有LRR 结构域的基因，最终获得161 个具有完整的F-box 以及LRR 结构域的BnF-box-LRR基因。BnF-box-LRR 蛋白中包含的F-box基序均位于N 端，大小在40～50个氨基酸，保守性较高。如图1 所示，BnF-box-LRR家族中F-box 基序含49 个氨基酸残基，包含多个极度保守的氨基酸，主要位于第4 位、16 位、29 位、32 位的丝氨酸残基（S），第22位、28 位的苏氨酸残基（Thr，T），以及多个天冬氨酸（D）、异亮氨酸（I）、亮氨酸（L）、脯氨酸（P）、赖氨酸（K）、色氨酸（W）等氨基酸残基。

图1 甘蓝型油菜BnF-box-LRR 家族蛋白保守基序分析Fig.1 Conserved Motif analysis of BnF-box-LRR protein in Brassica napus

2.2 BnF-box-LRR基因进化树构建

为明确BnF-box-LRR基因的亲缘关系，本研究将161 个BnF-box-LRR以及4 个已知参与植物生物胁迫的拟南芥AtF-box-LRR基因一起构建系统发育进化树。结果表明，BnF-box-LRR可以分成4 个明显的亚家族（FBXLRR1、FBXLRR2、FBXLRR3、FBXLRR4），其中FBXLRR1 亚族中有69 个基因，FBXLRR2亚族中有38个基因，FBXLRR3亚族中有26个基因，FBXLRR4 亚族中有28 个基因（图2）。除了极个别成员C 端包含的结构域有所不同外，具有相同C 端结构域的F-box 蛋白倾向于聚集在系统发育树的同一类群中：FBXLRR1 亚族（69）含有F-box 结构域和LRR2 结构域，大部分成员含有FBD 结构域；FBXLRR2亚族（38）与FBXLRR1亚族的进化关系较近，因此含有的保守结构域也极为类似，但是FBXLRR2 亚类中部分成员含有2 个以上的F-box 以及FBD 结构域；FBXLRR3 亚族（26）中的成员仅含有F-box 和LRR2，仅有两个成员含有FBD 结构域；FBXLRR4 亚族（28）成员中绝大多数（2 个基因除外）含有F-box 和LRR6 结构域（图3）。四个AtFbox-LRR与FBXLRR4 亚族聚为一支，其中AtMAX2与BnaC07g16230D，BnaA07g12080D 位于同一进化分支；AtEBF1（乙烯受体）与BnaA04g14890D 在同一分支上；COI1（茉莉酸受体）、TIR1（生长素受体）与BnaC01g26530D 以及BnaA01g21140D 位于同一分支，暗示FBXLRR4 亚族成员可能行使与拟南芥同源基因相同或相近的功能（图2）。

图2 BnF-box LRR蛋白的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of BnF-box-LRR proteins

图3 BnF-box LRR家族主要结构域示意图Fig.3 Primary structure functional domains of BnF-box LRR

2.3 BnF-box-LRR 基因的结构以及保守结构域分析

本研究进一步根据进化分类研究BnF-box-LRR的基因结构分布规律。如图4 所示，同一亚族的基因外显子数目以及外显子、内含子的长度相似。FBXLRR1亚族中内含子数目较少，平均内含子数目为1.6，其中有5 个基因没有内含子，除8 个长的基因以外，其它基因大小在2 kb 左右。BnaC02g1 2330D 具有最长的一个内含子。FBXLRR2 亚族内含子数目比FBXLRR1 亚族多，平均内含子数目为4.05，有8 个基因内含子较长，其它基因大小在2 kb左右。FBXLRR3 亚族中平均内含子数目为3.7，有4 个基因较长，其它基因大小在2.5 kb 左右。FBXLRR4 亚族内含子数目比FBXLRR3 亚族少，但是基因的平均长度比FBXLRR3亚族长。

图4 甘蓝型油菜F-box LRR基因家族结构分析Fig.4 Family structure of F-box LRR in B.napus

利 用MEME（http://meme-suite. org/）对BnFbox-LRR 家族进行保守结构域预测。各亚族成员所包含的motif种类以及数目有一定差异，同一亚族内的BnF-box-LRR保守序列分布较为相似。FBXLRR1 与FBXLRR2，FBXLRR3 这3 个亚族中包含的motif 种类相似，数目有所不同，而FBXLRR4 亚族的保守结构域与其它3 个亚族具有较大差异（图5）。FBXLRR4 亚族中不含motif1，且所有成员包含的motif 种类和数目均较少，平均motif 种类为4 个。其中motif14、16、19 为该亚族特有的，motif13 和motif14 是该亚族共有的保守结构域（图5）。所有的Motif 通过Smart 在线分析，发现Motif1，Motif16，Motif19 为F-box 结构域，Motif 5 为FBD domain，Motif2、3、14 为亮氨酸重复序列，其它Motif 为包含F-box domain的序列。

图5 BnF-box LRR 保守基序分析Fig.5 Conserved motif analysis of BnF-box-LRR

2.4 FBXLRR4亚族基因组织表达分析

基于以上分析，本研究发现FBXLRR4 亚族在基因结构以及蛋白保守性与其它三个亚族显著不同，且与功能已知的AtF-box-LRR基因亲缘关系较近，因此推测该家族基因可能参与植物的逆境胁迫。所以，本研究进一步分析了FBXLRR4 亚族的基因在油菜根、茎、叶、花、角果等5个组织中的表达情况。由于FBXLRR4 亚族的基因表达量差异较大，因此对所有基因的FPKM 值取log2。如图6 显示F-box-LRR4亚族中的28个基因可以分为两个分支。第I 分支中的13 个基因中有8 个基因数据来源在根中的表达量比其它组织中高，5 个基因在各个组织中的表达量均较低。其中BnaC08g45410D 在根中特异性表达，在其它组织中均没有表达。第II分支中15个基因在各个组织中的表达量均较高，其中有4 个基因在各个组织中的表达量都非常高（BnaA04g11740D，BnaC04g28330D，BnaA04g14890D，BnaC04g37750D），11个的基因仅在根和叶组织中有较高的表达。从组织特异性表达数据可以看出，FBXLRR4 亚族的基因倾向于在根和叶片中高表达。

图6 第4亚家族BnF-box LRR 基因的组织表达Fig.6 Tissue expression of BnF-box LRR genes in subgroup 4

2.5 FBXLRR4亚族基因对核盘菌诱导的应答分析

为明确FBXLRR4 亚族基因是否响应核盘菌的诱导表达，本研究进一步分析了FBXLRR4 亚族基因在抗病品种中油821和感病品种Westar接种核盘菌前后（0 h 和24 h）的表达情况。如图7 所示，接种核盘菌以后，抗病品种中油821 和感病品种Westar中的FBXLRR4 亚族中28 个基因接种核盘菌后的表达模式可以分为两支，第I 支中有12 个基因，在0 h时，大部分基因在抗感两个品种中的表达水平接近（BnC09g04050D 除外），而在接种核盘菌24 h 以后，这些基因在抗感两个品种均下调表达。其中9个基因在抗感两个品种中的起始表达水平较低，接菌24 h 后，这些基因出现一定程度的下调，3 个基因在这两个品种中的起始表达水平较高，接菌24 h 后，这些基因出现较大幅度的下调。第II 支中有16 个基因，这些基因在抗感两个品种中的平均表达水平较高，接种核盘菌24 h 后，有10 个基因上调表达，6 个基因下调表达。从表达变化幅度看，FBXLRR4亚族中的28 个基因有16 个基因的表达水平变化在2 倍以上，其中有9个基因下调表达，7个基因上调表达，其中BnaC03g28330D 和BnaA03g23830D 在抗病品种中分别下调19 倍和9 倍，而在感病品种中下调3.5倍和3.4倍；BnaA09g04600D 在感病品种中下调6.5倍，在抗病品种中下调1.3倍。上调表达的基因中BnaC09g07370D、BnaA09g07490D、BnaC07g2941 0D 以及BnaA06g27640D 这四个基因的上调幅度较大，BnaA09g07490D 在抗病品种中上调幅度最大，达到43倍。为验证以上转录组结果，本研究中以抗病品种中油821 为材料，在温室中种植中油821，在其长到5 叶期，接种核盘菌菌丝，在0 h、12 h、24 h、48 h 分别取样，对接种前后明显上、下调表达的6 个BnF-box-LRR基 因，FBXL1（BnaA09g07490D），FBXL2（BnaC07g29410D）、FBXL3（BnaA06g27640 D）、FBXL4（BnaC09g07370D）、FBXL5（BnaC03g2833 0D）、FBXL6（BnaA03g28330D）进行实时荧光定量PCR 验证。结果如图8 所示，FBXL1-4 在抗病品种中，接种核盘菌以后，这4 个基因均上调表达，48 h时上调幅度最大，而FBXL5、FBXL6这两个基因在接种核盘菌以后下调表达，菌诱导时间越长，下调幅度越大。以上结果初步证实FBXLRR4 亚族中的BnF-box LRR基因参与油菜菌核病抗性功能。

图7 第4亚家族BnF-box LRR 基因受核盘菌诱导的表达分析Fig.7 Expression analysis of BnF-box-LRR genes in subgroup 4 in response to Sclerotinia fungi induction

图8 候选BnF-box-LRR基因核盘菌诱导表达的荧光定量PCR验证Fig.8 Expression of candidate BnF-box LRR genes in response to S.sclerotiorum induction by real-time PCR

3 讨论

F-box基因家族是植物中最大的基因家族之一，在植物的生命进程中发挥着重要的作用。Fbox 结构域多位于基因的N 端，介导蛋白的降解，而C 端结构域负责蛋白的特异性互作。由于C 端结构的多样性，F-box基因能够参与植物多种多样的生物学功能，包括生长发育、信号转导以及逆境响应等。LRR 结构域普遍存在于植物抗病基因中，可直接或间接地与病原菌效应蛋白互作启动植物防御系 统[48]。研 究 表 明，LRR 结 构 域 常 与WRKY[49]、AP2[50]以及Pkinase[51]等结构域组合在一起，特异性识别病原效应子激发植物抗病反应[52,53]。F-box-LRR基因亚类是F-box家族重要的一个分支，该类基因在植物抗病中的功能以及作用机理目前尚未得到深入解析。

由核盘菌引起的菌核病是油料作物尤其是油菜面临的最重要的真菌性病害，该病害对油菜的产量和品质损害极大，因此迫切需要培育油菜菌核病抗性品种[5]。但是，由于菌核病为非专性寄生真菌，其侵染范围几乎覆盖所有的双子叶植物和部分的单子叶植物，且为数量遗传抗性，由主效基因加微效基因控制，作用机理非常复杂，到目前为止对核盘菌的致病机理研究并不是很深入。此外，在油菜中尚未发现对菌核病完全免疫的品种，也极大地限制了油菜菌核病抗性基因的挖掘。尽管如此，研究者还是鉴定到多个参与油菜菌核病抗性的功能基因如WRKY以及MPK等基因[49]。随着多个物种基因组序列的持续公布，为从全基因组水平鉴定基因提供了极大的便利，可以从正向遗传学角度去探索基因的功能。本研究在甘蓝型油菜基因组中鉴定到161 个F-box-LRR基因，亲缘进化分析表明FBXLRR4 亚族基因与拟南芥参与植物生物胁迫的4 个功能基因聚为一类，因此推测该分支基因可能执行类似的生物学功能。转录组分析揭示FBXLRR4 亚族的基因在根以及叶片组织中的表达量均高于其它3 个组织，且其表达水平在不同抗性品种接种核盘菌后具有明显的应答差异。本研究进而挑选了6个变化幅度较大的BnF-box-LRR基因，通过实验验证了其在菌核病高抗品种中油821中的核盘菌诱导后不同时间点的变化趋势，为后续通过分子调控这些基因表达来研究其抗病功能提供基础。未来在明确了候选BnF-box-LRR基因的菌核病抗性功能后，对其抗病作用机理的解析是本研究感兴趣的一个点。BnF-box-LRR中LRR 结构域在病原菌或者植物中的互作靶标是什么，F-box 是否通过泛素化降解互作蛋白，该过程对菌核病抗性具有何生物学意义，后续的研究将系统回答这一系列问题。

综上所述，本研究从全基因组水平在甘蓝型油菜中鉴定了F-box-LRR家族成员，利用生物信息学方法对其序列特征以及进化分类进行了系统归类，结合转录组数据发现FBXLRR4 亚族基因可能参与植物菌核病防御，为后续基因的功能研究提供基础，也为功能基因的挖掘提供可借鉴的方法和思路。