小儿尿道下裂患者包皮组织中COX-2、TIMP1表达及临床意义*

彭潜龙 田 稳 李创业 聂有能 赵夭望

湖南省儿童医院 泌尿外科（湖南 410000）

尿道下裂（Hypospadias）是由于前尿道发育异常，尿道开口达不到正常位置，是小儿泌尿生殖系统疾病最常见的畸形之一，常伴有阴茎短小、下弯，使患儿不能站立排尿，甚至影响患儿成年后性功能和生育能力，严重影响患儿的身心健康。尿道下裂唯一的治疗方法是手术矫正，但伴有较高的并发症发生率，近年来，尿道下裂发病率高达0.4%，且仍有上升的趋势，抗雄激素物质或雌激素是导致尿道下裂的一个重要原因[1,2]。因此，寻找与小儿尿道下裂有关的生物标志物，对改善患儿生活质量具有重要意义。环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）是一种诱导酶，正常生理情况下处于不表达或低表达，但在一些病理情况下高表达，大量研究表明，在细胞受到炎症因子、化学药物、癌基因等刺激时COX-2被迅速合成，从而参与炎症反应、组织损伤、肿瘤的发生等，此外有研究报道，孕激素可刺激COX-2高表达，随后COX-2诱导合成过量雌激素，从而促进子宫内膜癌的发生[3,4]。但关于COX-2在尿道下裂患儿包皮组织中的表达情况研究较少。金属蛋白酶组织抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP1）为基质 金 属 蛋 白 酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的 天然抑制剂，MMPs在人体内广泛分布，参与血管形成、胎膜破裂、胚泡植入、肿瘤浸润转移、炎症反应、内分泌失调等病理生理过程。TIMP1能够和MMPs特异性结合，阻断MMPs激活过程，阻碍MMPs与底物结合，抑制MMPs发挥降解作用，从而使睾酮等分泌异常，使机体内分泌紊乱动态平衡遭到破坏，从而引发一系列病理生理变化[5,6]。但是关于TIMP1在尿道下裂患儿包皮组织中的表达方面的研究较少，本研究采用免疫组化法检COX-2、TIMP1在小儿尿道下裂患者包皮组织中的表达情况，并探讨其与小儿尿道下裂之间的关系。

资料与方法

一、研究对象

选取2020年6月至2021年6月在我院泌尿外科收治的小儿尿道下裂患者151例为尿道下裂组，年龄5～11岁，平均年龄（6.91±1.62）岁；另选取71例尿道外口正常者为正常对照组，年龄4～12岁，平均年龄（7.48±1.59）岁；根据阴茎伸直后尿道外口位置将尿道下裂组患儿分为轻型组48例（阴茎远侧型、冠状沟型、阴茎头型）、中型组50例（后2/3阴茎干型）、重型组53例（会阴型、阴囊型、阴茎阴囊型）。纳入标准：①临床上通过典型的临床表现和泌尿系的B超检查等确诊为尿道下裂；②无手术矫正史；③无两性畸形或者其他系统疾病。排除标准：①合并尿道下裂以外的生殖器畸形；②合并其他器官的畸形和内分泌的异常；③临床资料不全。本研究经我院伦理委员会批准（批件号：HCHLL-2020-47），所有受试者及其监护人对本研究知情同意，并自愿签署知情同意书。

二、主要试剂与仪器

兔抗人COX-2、TIMP1抗体、羊抗兔IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB显色剂购自武汉博士德生物工程公司；显微图像采集系统购自Nikon生物显微镜&SPOT成像系统，石蜡切片机购自英国SHANDON公司，双目光学显微镜购自日本OLYMPUS公司，分光光度仪购自美国GretagMacbeth公司。

三、标本采集

取小儿尿道下裂患者手术后留取的包皮组织，同时留取阴茎发育正常包皮环切手术者的包皮组织，分别标记后放于-80℃中保存，待测。

四、免疫组织化学法检测组织中COX-2、TIMP1表达

取出标本并进行切片，处理后分别滴加兔抗人COX-2（1:400）、TIMP1（1：400）抗体作为一抗，4℃过夜，用PBS冲洗，滴加生物素标记羊抗兔IgG二抗（1:1000），用PBS清洗3次，之后滴加DAB显色进行染色，严格按照说明书操作，5-10min后用显微镜观察染色情况，COX-2、TIMP1表达均为包皮组织真皮层纤维细胞胞浆内和/或胞膜，以细胞胞浆/胞膜内出现棕黄色为阳性。

五、结果判定

使用光学显微镜观察，分别对和正常对照组中每张切片随机挑选并对COX-2、TIMP1阳性细胞数量进行统计。①根据阳性百分率＜6%为0分、7%～29%为1分、29%～49%为2分、49%以上为3分。②根据着色强度：0分为无着色、1分为浅黄色、2分为棕黄色、3分为棕褐色，③根据二者乘积得到总分：≤3分为阴性（-），3～5分为弱阳性（+）；6～8分为中度阳性（++）；9～10分为强阳性（+++），+～+++均为阳性表达。

六、统计学方法

采用SPSS 19.0对数据进行统计学描述，计数资料采用[n（%）]进行描述，三组间比较采用单因素方差分析，采用Spearman法分析小儿尿道下裂患者包皮组织中COX-2、TIMP1的相关性，Logistic回归分析与尿道下裂发生的有关因素，以P＜0.05代表具有统计学意义。

结 果

一、COX-2、TIMP1在正常对照组和小儿尿道下裂患者的表达情况比较

正常对照组包皮组织COX-2表达阳性19例，阴性52例，尿道下裂患者包皮组织COX-2表达阳性121例，阴性30例，小儿尿道下裂患者中包皮组织COX-2的阳性表达率高于正常对照组（P＜0.05）；正常对照组包皮组织TIMP1表达阳性48例，阴性23例，尿道下裂患者包皮组织表达阳性38例，阴性113例。小儿尿道下裂患者中包皮组织TIMP1的阳性表达率低于正常对照组（P＜0.05），详见表1，图1。

表1 COX-2在正常对照组和小儿尿道下裂患者的表达情况比较

图1 免疫组化图

二、不同程度小儿尿道下裂患者包皮组织中COX-2、TIMP1的表达情况比较

小儿尿道下裂患者中包皮组织COX-2的阳性表达率：重型组＞中型组＞轻型组（P＜0.05），TIMP1的阳性表达率：轻型组＞中型组＞重型组（P＜0.05），详见表2。

表2 COX-2在正常对照组和小儿尿道下裂患者的表达情况比较

三、小儿尿道下裂患者包皮组织COX-2、TIMP1的相关性

小儿尿道下裂患者包皮组织COX-2与TIMP1的表达有关（r=-0.514，P＜0.05），详见表3。

表3 小儿尿道下裂患者包皮组织COX-2、TIMP1的相关性

四、二元Logistic回归分析小儿尿道下裂影响因素

将是否发生小儿尿道下裂作为因变量，以雌二醇、睾酮、包皮组织COX-2、TIMP1阳性表达作为水平自变量，进行二元Logistic回归分析，结果显示雌二醇、睾酮、COX-2、TIMP1水平与小儿尿道下裂的发生有关（P＜0.05），详见表4。

表4 尿道下裂的影响因素分析

讨 论

尿道下裂是儿童较为常见的泌尿生殖道先天畸形，约占新生男婴的0.3%-0.5%，仅次于先天性心脏病，且近年来仍然呈上升趋势，尿道下裂的病因涉及遗传因素、环境因素、激素调控、基因突变等，妊娠早期母体接触农药、辐射、吸烟（被动）等都可能会增加尿道下裂的发生率。尿道下裂的病因和发病机制比较复杂，目前仅有低于5%的患儿能找到确切的发病原因，但对于大多数的尿道下裂患儿的病因仍然不是很了解，因此，寻找与小儿尿道下裂有关的生物标志物，对改善患儿生活质量具有重要意义[7,8]。

COX-2是经过细胞因子等诱导下表达，与炎症反应、肿瘤的发生发展有关，近年来研究发现，Cox-2在多种癌组织，如子宫内膜癌、结肠癌呈高表达[9,10]。Ellen[11]等详细介绍了COX-2在生殖内分泌领域中的作用，在内膜异位症患者腺上皮中COX-2的表达高于正常妇女，提示COX-2的表达与内膜异位的发生有关。梁金红[12]研究结果表明，COX-2子宫内膜癌中呈高表达，提示COX-2在子宫内膜癌的病理生理过程中起重要作用。杨勇波[13]等研究结果表明，宫颈癌组织中COX-2呈高表达，且与化疗敏感性密切相关，可用于宫颈癌病人新辅助化疗治疗前化疗敏感性的预测。妊娠早期母体的雌激素干预可引发胎儿发生先天性尿道下裂，COX-2可能参与了雌激素的信号转导通路，其与小儿尿道下裂的发生有关[7]，本研究结果表明，与对照组比较，小儿患者COX-2阳性表达率升高，且COX-2阳性表达率随小儿尿道下裂患者病情的加重而升高，提示COX-2可能在尿道下裂的发生中发挥一定的作用，与尿道下裂的严重程度密切相关，推测COX-2表达可能诱导雌激素分泌，通过介导雌激素的信号转导通路参与了小儿尿道下裂的发生发展过程；多因素Logistic回归分析结果表明COX-2是小儿尿道下裂患者发生的危险因素，提示COX-2可能与尿道下裂的发生具有一定的关系。

TIMP-1是一种相对分子质量28000的糖蛋白，能够与活化的间质胶质酶、间质溶解素、MMP-9以非共价键形成复合物，抑制酶原的活化[14]。周琦[15]等研究结果表明，子宫内膜异位症组织中TIMP-1与侵袭程度呈负相关，TIMP-1随着子宫内膜异位症临床分期的升髙而降低，提示人工诱导TIMP-1表达可能抑制内异症的发生发展。满冬梅[16]等研究结果表明，子宫内膜异位症患者异位内膜中TIMP-1 mRNA的表达下调，基质金属蛋白酶9（MMP-9）表达上调，TIMP-1降低了对MMP-9的抑制作用，从而使异位内膜细胞具有更强的侵袭能力以及异位种植能力，提示TIMP-1、MMP-9在子宫内膜异位症的发生发展过程中起极其重要的作用。尿道下裂由于胎儿内分泌紊乱主要是双氢睾酮和睾酮的分泌紊乱而发生疾病，TIMP-1的异常表达可能是一种继发性改变从而致使小儿尿道异位形成尿道下裂[7]。本研究结果表明，与对照组比较，小儿尿道下裂患者TIMP1阳性表达率降低，且TIMP1阳性表达率随小儿尿道下裂患者病情的加重而降低，提示TIMP1能反映小儿尿道下裂患者病情的严重程度，推测TIMP-1低表达可能减少了对MMP的激活，无法降解睾酮等激素，使机体睾酮等激素水平异常发生内分泌紊乱平衡失调，从而参与小儿尿道下裂的发生发展过程；经Pearson法分析小儿尿道下裂患者COX-2、TIMP1表达呈负相关，提示COX-2、TIMP1可能共同参与疾病发生发展，多因素Logistic回归分析结果表明TIMP1是小儿尿道下裂患者发生的危险因素，提示TIMP1的异常表达可能在尿道下裂发展演变存在一定关系。

综上所述，COX-2、TIMP1表达情况可能与尿道下裂的发生发展演变有关，有望成为尿道下裂潜在的研究靶点。