蒺藜苜蓿膜联蛋白MtANN2 基因的表达模式及盐胁迫下的功能分析

刘亚男 ，于人杰 ，高燕丽 ，康俊梅 ，杨青川 ，武志海 *，王珍 *

（1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2. 吉林农业大学农学院，吉林 长春 130118；3. 浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300）

植物膜联蛋白（annexins）是一类进化保守的多基因家族蛋白，通过Ca2+与膜磷脂的结合参与多种生物学过程［1-2］。据报道，水稻（Oryza sativa）有 9个，玉米（Zea mays）有 12个，大豆（Glycine max）有 22个膜联蛋白编码基因［3］。研究发现植物能够通过调节体内膜联蛋白的表达水平增强自身对逆境的忍受力。例如，芜菁亚种（Brassica rapa）中分离鉴定出4个膜联蛋白基因（BrANN1～4），它们均受干旱、盐和极端温度的诱导［4］。异源过表达芥菜（Brassica juncea）BjANN2的转基因烟草（Nicotiana tabacum）对盐胁迫的耐受性显著增强［5］。干旱及盐处理后，小麦（Triticum aestivum）TaANN10和TaANN12的表达量显著上升［6］。水稻中过表达OsANN3导致植株内的ABA 积累量显著高于野生型，这意味着OsANN3可能通过ABA 信号提高植物对干旱以及渗透胁迫的耐受性［7］。因此，过表达同源或异源膜联蛋白基因能增强转基因植物对高盐、干旱等逆境的耐受性。相反的，膜联蛋白基因功能缺失导致植物对逆境胁迫更敏感。如，拟南芥（Arabidopsis thaliana）atann4缺失突变体在盐胁迫条件下胞质内Ca2+浓度变化显著低于野生型，同时突变体出现明显的盐敏感表型，具体表现为发芽率低及苗期叶绿素含量下降［8］。

在我国，豆科饲草紫花苜蓿（Medicago sativa）种植区域主要集中在北方。为了提高土地利用率，黄淮海地区的盐碱地广泛用于种植苜蓿。通常，盐胁迫会导致植物受到离子胁迫、渗透胁迫、次生胁迫以及氧化胁迫的危害［9］。在盐渍土壤条件下生长的植物会经历高渗透胁迫、离子毒性和营养失调，直接造成植物生产力的下降，从而降低作物产量以及牧草品质［10］。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是目前公布的与紫花苜蓿亲缘关系最近的豆科植物，由于其基因组序列已知、基因功能注释完善，已作为豆科模式物种被广泛应用于植物基因生物学功能解析和豆科饲草遗传育种中［11］。目前，对于蒺藜苜蓿膜联蛋白的研究集中在根瘤的生长调控方面。如，MtANN1基因能被根瘤菌诱导而在根瘤中大量表达，它参与根组织中结瘤因子（Nod 因子）信号转导的早期阶段，并直接调控根瘤生长发育过程［12-13］。本研究克隆了蒺藜苜蓿膜联蛋白家族成员MtANN2基因，利用原位杂交技术发现了其在根原基特异表达的特点，筛选鉴定了拟南芥同源基因的纯合突变体atann2，异位表达MtANN2的atann2成功恢复了表型及对盐处理的响应。以上试验结果暗示蒺藜苜蓿膜联蛋白基因MtANN2可能在植物应答盐胁迫中起正向调节的作用。因而，MtANN2可作为紫花苜蓿耐盐分子育种的备选基因。

1 材料与方法

1.1 植物材料与生长

蒺藜苜蓿R108 生态型、拟南芥Col-0 生态型及本氏烟草种子均由本实验室保存。拟南芥AtANN2（At5g65020）的 T-DNA 插入突变体（CS717982）购自 Arabidopsis Biological Resource Center（https：//abrc. osu.edu/）。蒺藜苜蓿种子破除硬实后，放置于浸湿的滤纸上，4 ℃春化2 d 后放于人工气候培养箱，待子叶张开后移至1/2 Hoagland 营养液（购自西美杰）中，每周更换一次营养液。拟南芥种子用NaClO（10%）消毒10 min，无菌水清洗 5 次，种在 1/2 MS 固体培养基（15 g·L-1蔗糖和 5.5 g·L-1琼脂）中，4 ℃春化 2 d 后转于人工气候培养箱，待真叶长出后移入土中（营养土∶蛭石=1∶1）。烟草种子播种于土壤中，发芽后移至花盆（每盆1 株），人工气候室培养4 周。植物培养条件均为：光照16 h/黑暗8 h（22 ℃/20 ℃），相对湿度60%。

1.2 基因克隆、载体构建及植物转化

根据 Ensemble Plants 数据库（http：//plants. ensembl. org/index. html）中蒺藜苜蓿MtANN2基因编码序列（CDS）设计引物MtANN2 F/R（表1），利用Ex Taq DNA 聚合酶（Takara）进行目的片段扩增。将PCR 产物进行琼脂糖凝胶（0.8%）电泳，经回收纯化（TransGen），与pEASY-T5 载体（TransGen）连接后，连接产物转化大肠杆菌感受态（Trans-T1，TransGen），对菌落PCR 为阳性的克隆进行测序（天一辉远生物公司），保留序列正确的克隆。连接超表达载体（pCAMBIA1302）方法参照2×Assembly mix 无缝克隆试剂盒（smarter clone），即设计接头引物1302-MtANN2 F/R 使两端含有15～25 bp 与线性化载体同源的序列（表1），以MtANN2序列正确的克隆为模板，进行PCR 扩增。利用限制性内切酶Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ（quick cut，Takara）双酶切载体pCAMBIA1302。经无缝克隆酶50 ℃作用15 min，转化大肠杆菌测序，获得35S∶∶MtANN2-GFP融合表达载体。将重组子转化农杆菌（GV3101，华越洋），利用花序侵染法转化拟南芥。收获种子（T0代），用潮霉素（hygromycin，10 mg·L-1）筛选转基因阳性植株，至收获T2代纯合株系。

表1 试验中所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 植物材料的处理

4 周龄蒺藜苜蓿在NaCl（200 mmol·L-1）处理0、1、2、4、8、12、24 h 后分别收集根系，液氮速冻。拟南芥发芽试验中，种子消毒后分别种在 1/2 MS 无添加培养基（2.22 g·L-1MS basic 培养基，15 g·L-1蔗糖，5.5 g·L-1琼脂）（对照）和含有NaCl（100 mmol·L-1）的培养基上（处理），连续7 d 统计发芽率。对根系生长试验，待拟南芥主根长至2～3 cm 时，选取长势一致的幼苗移至对照和处理（NaCl，100 mmol·L-1）培养基上，竖直培养10 d 后统计根系生长指标，以对照组中野生型的指标值为1，计算其余数据的相对值。

1.4 突变体鉴定及基因表达分析

参照植物基因组DNA 提取试剂盒说明书（康为世纪），提取拟南芥野生型及突变体的基因组DNA。利用TDNA 上的右边界引物（RB）和基因特异引物LP 和RP（表1），鉴定纯合突变体。植物总RNA 提取参照Promega试剂盒说明书，利用Takara cDNA 合成第一链试剂盒进行反转录，保存于-20 ℃。采用实时荧光定量（SYBR，Takara）进行扩增（ABI 7300 Real Time PCR System），定量引物序列见表1。试验样品均设置3个生物学重复，数据采用 2-ΔΔCt方法［14］计算。

1.5 亚细胞定位

将含有35S∶∶MtANN2-GFP融合表达质粒的农杆菌按照 1∶100 接种于 20 mL 含卡那霉素（50 mg·L-1）和利福平（25 mg·L-1）的 YEB 液体培养基（10 g·L-1胰蛋白胨，1 g·L-1酵母，1 g·L-1MgSO4，5 g·L-1蔗糖）活化至光密度（optical density，OD）=0.6～0.8，再次按照1∶100 的比例二次活化至菌液OD=0.8～1.0，将菌液沉淀（5000 r·min-1，5 min），利用缓冲液（10 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-12-N-吗啉代乙磺酸 MES、150 μmol·L-1乙酰丁香酮，pH=5.3）重悬菌体至OD=0.8～1.0，室温黑暗静置3 h，利用注射器注射4 周龄本氏烟草下表皮后，培养48～72 h，利用共聚焦荧光显微镜（Leica TCS SP8，德国）观察荧光。

1.6 RNA 原位杂交

原位杂交按照Zachgo［15］的方法操作。简述如下：将苗龄14 d 的蒺藜苜蓿根经固定、脱水、透明、浸蜡后，包埋于石蜡中，制备根尖石蜡切片（8 μm）。利用 DIG RNA labelling kit（Roche）合成 RNA 探针，其中，带有 T7/SP6 RNA 聚合酶结合位点的基因特异片段（130 bp）分别转录为正义/反义探针（引物序列MtANN2-in situ F/R，表1）。将结构完整的材料经脱蜡，水合后与体外合成的RNA 探针杂交，显色后显微镜下观察信号。

1.7 生物信息学分析与数据处理

利用拟南芥的膜联蛋白序列查找蒺藜苜蓿和紫花苜蓿数据库［16-17］，对所获得的蛋白序列进行家族成员进化分析，通过 MEGA 软件（Version 7.0）的邻接法（neighbor-joining method）构建系统进化树，自举值（bootstrap）为1000。通过ExPASy（https：//www.expasy.org/）分析蛋白二级结构；试验数据利用SPSS 进行统计分析，结果均以平均值±标准误差表示。利用Power point 2016 和Excel 2016 作图。

2 结果与分析

2.1 蒺藜苜蓿膜联蛋白（annexins）家族成员的进化分析

用拟南芥膜联蛋白（8个）序列检索苜蓿数据库，分别比对到17个蒺藜苜蓿膜联蛋白和66个紫花苜蓿膜联蛋白。进化分析显示，相对于拟南芥，蒺藜苜蓿膜联蛋白与紫花苜蓿成员的亲缘关系较近，且通常4个紫花苜蓿膜联蛋白对应一个蒺藜苜蓿的同源蛋白（图1），这可能是由于紫花苜蓿基因组加倍造成的。序列分析发现，拟南芥中同源性最高（约为 86%）的 3个膜联蛋白为 AtANN2（At5g65020.1）、AtANN6（At5g10220.1）和 AtANN7（At5g10230.1），且3个基因都位于5 号染色体上。蒺藜苜蓿中，与这3个膜联蛋白同源性最高的基因为MTR_0276s0050（该基因尚未定位到蒺藜苜蓿的染色体上），其编码蛋白与AtANN2 同源性最高（70.65%），因此，将该基因命名为MtANNEXIN2（简称MtANN2）。

图1 拟南芥和2 种苜蓿中膜联蛋白的进化关系分析Fig.1 Phylogenetic analysis of annexin proteins from Arabidopsis and two Medicago species

2.2 MtANN2 的克隆及表达模式分析

从蒺藜苜蓿扩增到MtANN2的开放阅读框（948 bp）。该基因编码315个氨基酸，预测蛋白分子量为35.74 kDa，理论等电点为5.43，平均亲疏水指数为-0.526，为亲水性蛋白。二级结构以α-螺旋为主（68.25%），此外还含有无规则卷曲（23.49%）及延伸链和少量的β-折叠。

实时荧光定量（RT-qPCR）分析蒺藜苜蓿幼苗中MtANN2的表达情况，发现MtANN2在根系中高水平表达，表达量约为地上器官中的3 倍（图2A）。根系RNA 原位杂交结果显示，在蒺藜苜蓿侧根原基中有MtANN2反义探针杂交的蓝色信号，而与正义探针（阴性对照）杂交后根组织中未检测到明显的信号（图2B）。以上结果表明MtANN2主要在蒺藜苜蓿根系尤其是侧根原基中表达。

盐处理（200 mmol·L-1NaCl）蒺藜苜蓿 2 h 后，幼苗中MtANN2的表达水平升高到对照（0 h）的 2.1 倍。处理时间延长至24 h，其表达量基本维持在对照1.5 倍的水平，且差异显著（P＜0.05）（图2C）。所以，短时间盐处理能够诱导MtANN2的表达。

图2 MtANN2 的表达模式分析Fig.2 Analysis of the expression pattern of MtANN2 in M. truncatula

2.3 MtANN2-GFP 的亚细胞定位

瞬时表达烟草试验显示，对照（35S∶∶GFP）表达的信号分布在烟草表皮细胞核、细胞膜及部分胞质中。重组蛋白MtANN2-GFP 的绿色荧光信号主要位于细胞膜上（图3），表明MtANN2 是膜蛋白。这与水稻等植物膜联蛋白的研究结果一致［7，18］。

图3 MtANN2-GFP 的亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of the MtANN2-GFP recombinant protein in N. benthamiana

2.4 拟南芥atann2 突变体的鉴定及表型分析

为了研究MtANN2的功能，本研究筛选鉴定了拟南芥中AtANN2的T-DNA 插入突变体atann2。该突变体植株弱小，长势缓慢（图4A）。基因组PCR 鉴定表明，T-DNA 反向插入其第4个外显子，且该株系为纯合体（图4B、C）。RT-qPCR 结果显示，atann2中几乎检测不到AtANN2的表达（图 4D）。因此，atann2是该基因的功能缺失突变体。

根系比较试验显示，在正常生长条件下，atann2侧根数少于野生型，而主根长度差异不明显（图4E）。盐（100 mmol·L-1NaCl）处理后，野生型及atann2的根系生长均受到了抑制，侧根数目明显减少（图4E）。统计分析结果为，突变体和野生型在处理后相对主根长度、相对侧根数目及相对根鲜重均显著降低，且突变体各指标降低的幅度均高于野生型（37.92% vs. 25.94%；51.78% vs. 26.02%；55.45% vs. 26.00%）（图4F，G，H）。这说明相对于野生型，atann2缺失突变体对盐处理更敏感。

图4 atann2 突变体的鉴定及表型分析Fig.4 Screening and phenotypic analysis of atann2 mutant

2.5 异源表达MtANN2 的拟南芥atann2 植株耐盐性分析

本研究将35S∶∶MtANN2转入拟南芥atann2，转录水平检测证明具有潮霉素抗性的阳性转基因株系中MtANN2高丰度表达（图5）。选取两个异源表达株系（Line 6 和Line 11）进行盐处理，测定发芽率。统计结果表明在正常生长条件下，atann2前期发芽相对缓慢，而异源表达MtANN2的atann2株系与野生型发芽率接近（图6A）。盐（100 mmol·L-1）处理导致整体延迟出芽1～2 d，后期4 种基因型种子全部出芽。其中，两个转基因株系的趋势与野生型保持一致，而atann2在第4 和5 天的发芽率显著低于野生型（图6A）。上述结果表明，异源表达MtANN2能够将atann2突变体种子对盐处理的敏感性恢复到野生型水平。

图5 异源表达MtANN2 于拟南芥atann2 转基因材料转录水平鉴定Fig. 5 Identification of transcriptional level of MtANN2 in transgenic atann2

图6 异源表达MtANN2 的atann2 拟南芥对NaCl 的响应Fig.6 Analysis of atann2 ectopically expressing MtANN2 under NaCl treatment

对幼苗根系的分析表明，这两个转基因株系的主根长度和根鲜重都接近于野生型，侧根数介于atann2突变体和野生型之间，即MtANN2在一定程度上恢复了atann2根系的生长（图6B）。在盐（100 mmol·L-1NaCl）处理培养基上，所有植株的生长均受到抑制，转基因株系的相对侧根数目和根鲜重均显著高于atann2，相对根长介于atann2和野生型之间（图6C～E）。综合以上结果，异源表达MtANN2部分恢复了atann2的生长，并增强了转基因植株对盐胁迫的耐受性。

3 讨论

膜联蛋白是一类广泛存在于真核生物中高度保守的磷脂结合蛋白。近些年来，随着植物膜联蛋白家族的发现，关于该家族基因对逆境响应的研究日益增多。水稻、拟南芥、芥菜等多个物种的膜联蛋白均受到非生物胁迫的诱导［19-21］。同源或异源过表达膜联蛋白基因在一定程度上增强了转基因植物对非生物胁迫的忍受力［22-23］。本研究分析了蒺藜苜蓿MtANN2与豆科饲草紫花苜蓿中膜联蛋白家族基因的进化关系，利用拟南芥atann2突变体材料从分子水平上研究了MtANN2 作为一个典型的植物膜联蛋白在苜蓿生长及盐响应中的正调控作用。

蒺藜苜蓿MtANN2基因是典型的植物膜联蛋白家族成员。在植物进化过程中，膜联蛋白家族成员逐渐增多。例如，豆科牧草紫花苜蓿中膜联蛋白数目约为蒺藜苜蓿中其同源基因的4 倍。这可能是由于前者的基因组加倍导致的［17，24］。高等植物中annexins 具有较高的保守性［25-26］。在结构上MtANN2 具有膜联蛋白家族的核心结构域，即4个“annexin repeat”重复单元（Ⅰ～Ⅳ），且首尾两个重复单元（Ⅰ和Ⅳ）上均具有潜在的Ca2+结合结构域。其中，Ca2+结合区段通常在重复单元Ⅰ中高度保守，重复Ⅳ中相对可变［27］。另外，像大多数膜联蛋白家族成员一样，MtANN2-GFP 主要定位在细胞膜上。这与该家族蛋白通常在细胞膜上作为离子通道介导Ca2+内流，参与植物抗性调节相吻合［28］。由于高等植物膜联蛋白家族成员众多，部分成员定位在核膜、细胞核、叶绿体被膜、液泡膜等部位［7，22，29-31］。膜联蛋白在不同细胞器膜上的精细定位可能与其在植物进化中各成员间功能的精细分工有关。

蒺藜苜蓿MtANN2可能通过在根系中大量表达参与盐响应。对小麦10个膜联蛋白基因分析发现，5个在根中高丰度表达，8个基因能够响应NaCl 诱导［6］。拟南芥中与MtANN2同源性最高（70.65%）的基因为AtANN2。根据 Arabidopsis eFP Browser（https：//www.arabidopsis.org），拟南芥AtANN2在根中的绝对表达量是叶片中的3 倍，远远高于其他组织。本研究发现蒺藜苜蓿MtANN2在根中的表达水平是地上器官中的3 倍。拟南芥atann2突变体侧根数少，植株弱小，且对盐处理的盐敏感性显著高于野生型。这与其同源基因AtANN4缺失后的突变体表型一致［32］。因此，拟南芥中这两个膜联蛋白参与盐响应。本研究将蒺藜苜蓿MtANN2异源表达于拟南芥atann2，转基因植物不仅互补了拟南芥atann2的长势和表型，而且耐盐性也恢复到接近野生型的水平。本试验结果从分子水平上证明了蒺藜苜蓿MtANN2 是保守的膜联蛋白成员，并在植物盐响应过程中发挥重要作用。这与硬粒小麦（Triticum durum）、棉花（Gossypiumspp.）、拟南芥等物种中的膜联蛋白能够增强植物在盐胁迫下的耐受性一致［33-35］。另外，研究表明膜联蛋白的Ca2+结合活性为植物响应盐胁迫提供了途径，在盐胁迫下AtANN1、AtANN4可介导Ca2+转移至胞内，进而激活SOS1 转运体，调控下游应答基因的表达［32，36］。尽管异源表达MtANN2使atann2的根鲜重恢复到野生型的水平，但是侧根数目介于突变体和野生型之间。本研究推测MtANN2在侧根原基中高丰度表达可能与侧根起始有关。后续对蒺藜苜蓿MtANN2功能缺失突变体和超表达苜蓿植株的耐盐性分析将丰富该基因的生物学功能。豆科饲草紫花苜蓿有一个膜联蛋白成员与MtANN2 序列相似性高达97.5%。因此，本研究对蒺藜苜蓿MtANN2的研究结果可以为紫花苜蓿耐盐分子育种提供理论参考。

4 结论

植物膜联蛋白（annexins）家族由多个结构保守的膜磷脂结合蛋白组成，通常在植物抗逆中发挥重要作用。本研究针对豆科模式植物蒺藜苜蓿膜联蛋白基因MtANN2，进化分析表明其编码蛋白与紫花苜蓿膜联蛋白同源性较高，组织原位杂交揭示该基因在侧根原基中优势表达。进一步利用其拟南芥同源基因突变体（atann2），异源表达MtANN2成功恢复了突变体植株的表型。同时，外源MtANN2降低了atann2突变体对盐的敏感性。本结果暗示过表达MtANN2能够增强植物对盐胁迫的耐受性。蒺藜苜蓿MtANN2的研究结果对紫花苜蓿耐盐分子育种具有重要意义。