昆虫几丁质合成通路的研究进展

刘兰兰

昆虫几丁质合成通路的研究进展

刘兰兰

（西南林业大学云南昆明650224）

Candy等早在1962年就发表了完整的昆虫几丁质合成通路，并在沙漠蝗虫中证实了该通路共有8种酶参与其中。为了进一步深入研究昆虫几丁质的合成通路，文章梳理了该通路中8种酶的相关研究现状，通过对已有相关研究内容的综合分析，以期为昆虫几丁质合成通路的后续科学研究提供新的思路。

几丁质；合成通路；合成酶；研究进展

几丁质作为昆虫极其重要的结构性组分，参与昆虫表皮及中肠围食膜的形成[1]，能帮助昆虫抵御机械损伤，减少不良环境的危害。Candy和Kilby于1962年在沙漠蝗虫（desertlocust）中首次证实了完整的昆虫几丁质合成通路。整个通路起始于海藻糖，在8种酶的协助下，生成了最终的产物——几丁质[2]。之后随着越来越多的研究证实，这一昆虫几丁质合成通路已经得到验证及公认。

尽管昆虫几丁质合成通路中的8种酶都已经明确，其研究深度也从蛋白质水平深入到基因水平，但8种酶基因的研究深度及研究进展是不平衡的。总体来说，海藻糖酶（Tre）和几丁质合成酶（CHS）的研究较为深入，其余6种酶的研究较浅。对通路中8种酶的研究进展进行梳理，能更充分地了解昆虫几丁质合成通路的研究现状，从而为进一步加强对几丁质合成通路相关酶的研究及充分利用奠定基础。

1 几丁质的研究进展及其在昆虫中的功能

1.1 几丁质的发现

1811年，法国生物化学家Henri Braconnot发现了一种来自蘑菇的多糖，并称之为“真菌素”。后来Odier于1823年发现这种存在于蘑菇中的多糖在昆虫中也有存在，由于观察到这种多糖所发挥的功能类似于一种包膜或是被膜，Odier在希腊单词“壳聚糖”的基础上，将这种多糖命名为“几丁质”[3-4]。

1.2 几丁质的结构

从化学结构上看，几丁质是一种线性的多糖聚合物，纯天然的几丁质一般是由比例为5%～20%的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）残基和氨基葡萄糖（GlcN）残基所组成的杂聚物[5]。在结构上，几丁质与纤维素的区别并不大，唯一的不同点是几丁质单体第二个C原子上的乙酰氨基（—NHCOCH3）与纤维素单体第二个C原子上的羟基（—OH），如图1所示。乙酰氨基的替代使得相邻的几丁质链之间的氢键大大增加了，从而增强了纤维支架结构的强度，也使其更易形成多链[6]，赋予了几丁质可以构建各种细胞外基质支架的能力[7]。

图1　几丁质（左）与纤维素（右）的部分分子结构

1.3 几丁质在自然界的分布

目前已经有大量前人的研究证明，几丁质是自然界中多种生物不容小觑的结构组分[8]，其丰富度已达到地球上仅次于纤维素，是第二丰富的有机物[7]。在前人的研究成果中，已发现几丁质主要分布于甲壳动物、昆虫外骨骼及中肠围食膜，藻类、线虫、真菌以及软体动物的表皮中，且相关的大多数科研工作者认为，在高等植物、人类和其他脊椎动物体内没有几丁质的存在[9-11]。

1.4 昆虫中几丁质的功能

在昆虫中，几丁质既是昆虫外骨骼的重要成分，也是昆虫中肠围食膜的重要成分[1]，其作用如下：

（1）几丁质是昆虫外骨骼的重要支撑成分，使得昆虫在保持外在特定形态的基础上，还能保护内部器官免受外界的物理损伤，抵御不良环境带来的伤害。

（2）几丁质参与昆虫中肠围食膜基质的形成，能保护肠道细胞免受硬度较大的食物颗粒的损伤[12]。前人利用x-射线衍射对昆虫体内几丁质的结构进行了分析，证实几丁质在生物体中共有3种不同的结晶形式，如图2所示，目前3种晶体都已在昆虫中被证实存在[13-14]。

图2　昆虫几丁质的三种晶体形式[14]

2 昆虫几丁质合成通路的发现及其相关酶的研究进展

2.1 昆虫几丁质合成通路的发现

1962年，Candy等在沙漠蝗虫（desert locust）中验证了完整的几丁质合成通路。该通路全程有8种酶参与催化，首先是海藻糖酶（trehalase, Tre），中间经过了糖酵解途径的2种酶、己糖胺通路的4种酶，最后终止于通路中最重要几丁质合成酶（CHS）[2]，如图3所示。次年，Jaworski等就将这条通路在中得到证实，并在上发表了该成果[15]。之后随着相关研究的不断增多，这一昆虫几丁质合成通路已经被多次验证及公认。

图3　昆虫合成通路示意图[16]

2.2 昆虫几丁质合成通路相关酶的研究进展

2.2.1 海藻糖酶

合成途径中，第1个酶是海藻糖酶（trehalase, Tre; EC 3.2.1.28），Tre作为通路中的第一个催化酶，将一分子的海藻糖催化水解，从而产生两分子的葡萄糖[17]。昆虫中有可溶性海藻糖酶（Tre-1）与膜结合海藻糖酶（Tre-2）这两大类别的基因。有关-基因的报道最早是在1992年，Takiguchi等用同源性基因筛选的方法从黄粉虫雄性副腺中分离到一个-基因的cDNA[18]，而-基因直到2005年才被报道，Mitsumasu等完成了在家蚕（）中的-的分子克隆及其在幼虫中肠中的定位[19]。Lee等于2007年克隆出了欧洲蜜蜂（European honeybee）的膜结合海藻糖酶基因-的cDNA序列[20]。随后在甜菜夜蛾（）褐飞虱（）等昆虫中都有基因的克隆、分子特征及表达模式的相关报道[21-22]。

2.2.2 己糖激酶

合成途径中的第2个酶是己糖激酶（hexokinase, HK; EC 2.7.1.1），它开启了糖酵解途径，能催化多种功能蛋白的合成，并调控细胞凋亡及转录等活动。己糖激酶在昆虫几丁质合成通路中催化己糖磷酸化，并生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）[23-26]。

2.2.3 葡萄糖-6-磷酸异构酶

合成通路中的第3个酶是葡萄糖-6-磷酸异构酶（G6PI; EC 5.3.1.9），其也是糖酵解途径的第2个酶。G6PI是一种二聚体酶，能使得果糖-6-磷酸（F6P）与葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）发生双向的异构化[27-28]。G6PI不仅在合成几丁质的过程中发挥重要的作用，作为二聚体酶对多物质的合成都起到了催化作用，同时G6PI的单体形式还可以作为一种细胞因子活动，如人类脊椎白血病细胞的分化介导因子和成熟介导因子，以及神经白介素等[29-30]。

2.2.4 谷氨酸盐:果糖-6-磷酸转氨酶

合成通路的第4个酶是谷氨酸盐:果糖-6-磷酸转氨酶（GFAT; EC:2.6.1.16）。GFAT不但参与几丁质的生物合成和蛋白质糖基化的调控，还是其他复杂有机物合成过程中的一种重要酶，如雄性黑果蝇（）唾液腺黏液蛋白合成的第一步就是由GFAT催化的[31]。GFAT也是诱导TGF-β1和纤维连接蛋白在系膜细胞中表达所必需的[32]，还被证实是一种胰岛素调节酶，在培养细胞诱导胰岛素抵抗中发挥重要作用[33]。Huang等（2007）在其研究中报道了一种来自长角血蜱（）的新型GFAT（GFAT）的分子特征和潜在功能，实验过程使用RNA干扰GFAT后，成年雌性小鼠的充血率显著降低。这一效应的潜在机制可能是限制了GFAT的表达后几丁质的生物合成也受到了抑制，从而破坏了血液喂养过程中角质层的生长和围食膜基质的形成[34]。Liu等（2015）的研究表明，凡纳滨对虾（）胰腺中GFAT的表达水平会受到海洋中重金属残留和化学污染物的影响。在pH=9.3和镉的胁迫下，-基因的转录水平会明显提升。然而，在这些胁迫下，mRNA的表达水平在不同的时间达到峰值。以上结果表明，碱性条件（pH=9.3）和镉的胁迫可刺激-基因的表达，可能在凡纳滨对虾对抗环境胁迫中发挥关键的作用[35]。

2.2.5 葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶

合成通路的第5个酶是葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶（GNA; EC 2.3.1.4），催化葡糖胺-6-磷酸（glucosamine-6-phosphate, GlcN6P）生成N-乙酰葡糖胺-6-磷酸（N-acetylglucosamine-6-phosphate, GlcNAc6P）[36-37]。在前人的研究中，已经有布氏锥虫（）、酵母菌和人类的GNA三级结构的报道[38-41]。埃及伊蚊（）的基因表达也已经有了相关报道[42]。

2.2.6 乙酰氨基葡萄糖变位酶

合成通路的第6个酶是乙酰氨基葡萄糖变位酶（AGM; EC 5.4.2.3），它可以转移分子内的磷酸基团（磷酸转移酶或磷酸基化酶），并催化GlcNAc-6-P和GlcNAc-1-P的可逆转化。在真核生物中，乙酰化反应发生在分子内磷酸化转移的步骤之前，而在原核生物中，乙酰化反应发生在分子内磷酸化转移的步骤之后，因此原核生物和真核生物中UDP-GlcNAc的生物合成机制有所不同[43]。Kato等在2010年克隆了埃及伊蚊（）的基因，该基因在埃及伊蚊的整个龄期都有表达[44]。张政等在2019年利用RNAi实验发现，基因的沉默会致使约30%飞蝗（）出现死亡表型，推测其在飞蝗的新表皮合成过程中发挥了重要作用[45]。

2.2.7 UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶

合成通路的第7个酶是UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶（UAP; EC 2.7.7.23），它广泛分布于自然界中。从贾第鞭毛虫（）、粗糙脉孢菌（）、猪肝细胞、小牛肝和酵母菌中均得到部分纯化[46-50]。UAP作为关键糖基化蛋白质催化N-acetylglucosamine-1-phosphate和UDP-N-acetylglucosamine发生可逆反应，是昆虫几丁质合成通路中不可缺少的一个酶。目前在部分昆虫中已经得到基因的测序结果。Palaka等（2014）证明，埃及伊蚊在缺失UAP的情况下，昆虫会由于个体发育和外骨骼的形成受到阻碍而死亡[51]。

2.2.8 几丁质合成酶

昆虫几丁质合成通路中的第8个酶是几丁质合成酶（chitin synthase, CHS; EC 2.4.1.16），对于昆虫的几丁质合成途径来说，它是最关键、最重要的催化酶。CHS属于糖基转移酶家族，分子量超过170 kDa[52]，昆虫中有两种CHS，分别由（）基因和（）基因编码。基因通常在昆虫的表皮及气管中表达，编码的酶能催化表皮几丁质、气管几丁质的形成。基因则是在中肠围食膜中表达，编码的酶催化中肠围食膜的形成[52-53]。目前在直翅目、鳞翅目、膜翅目、半翅目等多种昆虫中都有基因的cDNA序列克隆及功能研究。如Ibrahim在2000年就克隆了埃及伊蚊中肠组织中基因的cDNA[54]，汪小东等（2014）采用同源基因克隆技术克隆了二斑叶螨（）的基因的cDNA全长，并进行了序列分析，结果表明该基因属于基因类型[55]。

3 展望

尽管昆虫几丁质合成通路中的所有相关酶都已经明确，其研究深度也从蛋白质水平深入到基因水平，但人们对昆虫中几丁质的生物合成途径的研究仍不是透彻的，例如几丁质合成酶的跨膜运输模式至今仍然还是处在模型分析的阶段。加强进一步的研究是该领域正在进行的重要工作。

[1]KRAMER K J,HOPKINS T L,SCHAEFER J.Applications of solids NMR to the analysis of insect sclerotized structures[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,1995,25(10):1067-1080.

[2]CANDY D J,KILBY B A.Studies on chitin synthesis in the desert locust[J].Journal of Experimental Biology,1962,39(1):129-140.

[3]ODIER A.Mémoire sur la composition chimique des par-ties cornées des insectes[J].Mem.Soc.Hist.Paris,1823,1:29-42.

[4].MUZZARELLI R A A,BOUDRANT J,MEYER D,et al. Current views on fungal chitin/chitosan,human chitinases,food preservation,glucans,pectins and inulin:A tribute to Henri B-raconnot,precursor of the carbohydrate polymers science,on the chitin bicentennial[J].Carbohydrate Polymers,2012,87(2):995-1012.

[5]MERZENDORFER H.The cellular basis of chitin synthesis in fungi and insects:Common principles and differences[J].European Journal of Cell Biology,2011,90(9):759-769.

[6]SAWADA D,NISHIYAMA Y,LANGAN P,et al.Direct de-termination of the hydrogen bonding arrangement in anhyd-rous β-chitin by neutron fiber diffraction[J].Biomacromolec-ules,2011,13(1):288-291.

[7]WAGNER G P,LO J,LAINE R,et al.Chitin in the epider-mal cuticle of a vertebrate (Paralipophrystrigloides,Blenniid-ae,Teleostei)[J].Cellular & Molecular Life Sciences Cmls,1993,49(4):317-319.

[8]李瑶,范晓军.昆虫几丁质酶及其在害虫防治中的应用[J].应用昆虫学报,2011,48(5):1489-1494.

[9]ANDERSEN S O.Biochemistry of insect cuticle[J].Annual Review of Entomology,1979,24(1):29-61.

[10]FUKAMIZO T,KRAMER K J.Mechanism of chitin hy-drolysis by the binary chitinase system in insect moulting fluid[J].Insect Biochemistry,1985,15(2):141-145.

[11]FUKAMIZO T,KRAMER K J.Effect of 20-hydroxyecd-ysone on chitinase and β-N-acetylglucosaminidase during the larval-pupal transformation of Manduca sexta (L.)[J].In-sect Biochemistry,1987,17(4):547-550.

[12]杨化恩,刘守柱,李友忠,等.昆虫几丁质合成酶及其抑制剂[J].昆虫知识,2007(5):769-773.

[13]LOTMAR W,PICKEN L E R.A new crystallographic modification of chitin and its distribution[J].Experientia,1950,6(2):58-59.

[14]RUDALL K M,KENCHINGTON W.The chitin system[J].Biological Reviews,1973,48(4):597-633.

[15]JAWORSKI E,WANG L,MARCO G.Synthesis of chitin in cell-free extracts of Prodenia eridania[J].Nature,1963,198(4882):790.

[16]DOUCET D,RETNAKARAN A.Insect chitin:metabolism,genomics and pest management[J].Advances in insect physi-ology,2012,43:437-511.

[17]SACKTOR B.Trehalase and the transport of glucose in the mammalian kidney and intestine[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of A-merica,1968,60(3):1007-1014.

[18]TAKIGUCHI M,NIIMI T,SU Z-H,et al.Trehalase from male accessory gland of an insect,Tenebrio molitor.cDNA sequencing and developmental profile of the gene expression[J].Biochemical Journal,1992,288(1):19-22.

[19]MITSUMASU K,AZUMA M,NIIMI T,et al.Membrane‐penetrating trehalase from silkworm Bombyxmori.Molecular cloning and localization in larval midgut[J].Insect Molecular Biology,2005,14(5):501-508.

[20]LEE J-H,SAITO S,MORI H,et al.Molecular cloning of cDNA for trehalase from the European honeybee,Apis mellifera L.,and its heterologous expression in Pichia pastoris[J].Bio-science,Biotechnology,and Biochemistry,2007,71(9):2256-2265.

[21]TANG B,CHEN X F,LIU Y,et al.Characterization and expression patterns of a membrane-bound trehalase from Spodopteraexigua[J].BMC Molecular Biology,2008,9(1):1-12.

[22]ZHAO L,YANG M M,Shen Q,et al.Functional characte-rization of three trehalase genes regulating the chitin meta-bolism pathway in rice brown planthopper using RNA inte-rference[J].Scientific Reports,2016,6(1):27841.

[23]MAGNANI M,SERAFINI G,STOCCHI V,et al.Solubili-zation,purification,and properties of rabbit brain hexokinase[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1982,216(2):449-454.

[24]PURICH D L,FROMM H J,RUDOLPH F B.The hexo-kinases:kinetic,physical,and regulatory properties[J].Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology,1973,39:249-326.

[25]WILSON J E.Studies on the molecular weight and lip-oprotein nature of glucose-6-phosphate solubilized rat brain hexokinase[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,1973,154(1):332-340.

[26]WILSON J.An introduction to the isoenzymes of mam-malian hexokinase types I-III[J].Biochemical Society Trans-actions,1997,25(1):103-107.

[27]MERKLE S,PRETSCH W.Glucose-6-phosphate isomerase deficiency associated with nonspherocytic hemolytic anemia in the mouse:an animal model for the human disease[J].Blood,1993,81(1):206-213.

[28]MERZENDORFER H,ZIMOCH L.Chitin metabolism in insects:structure,function and regulation of chitin synthases and chitinases [Review][J].The Journal of Experimental Bio-logy,2003,206(24):4393-4412.

[29]XU W,SEITER K,FELDMAN E,et al.The differentiation and maturation mediator for human myeloid leukemia cells shares homology with neuroleukin or phosphoglucose iso-merase[J].Blood,1996,87(11):4502.

[30]GURNEY M E,HEINRICH S P,LEE M R,et al.Molecular cloning and expression of neuroleukin,a neurotrophic factor for spinal and sensory neurons[J].Science,1986,234(4776):566-574.

[31]KRESS H,ENGHOFEr E.Kinetic characteristics and ont-ogeny of glutamine-fructose-6-phosphate-aminotransferase in Drosophila salivary glands[J].Insect Biochemistry,1975,5(2):171-181.

[32]WEIGERT C,FRIESS U,BRODBECK K,et al.Glutamine:fructose-6-phosphate aminotransferase enzyme activity is necessary for the induction of TGF-β1 and fibronectin exp-ression in mesangial cells[J].Diabetologia,2003,46(6):852-855.

[33]MCKNIGHT G,MUDRI S,MATHEWES S,et al.Molecular cloning,cDNA sequence,and bacterial expression of human glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase[J].Journal of Biological Chemistry,1992,267(35):25208-25212.

[34]HUANG X,TSUJI N,MIYOSHI T,et al.Characterization of glutamine:fructose-6-phosphate aminotransferase from the ixodid tick,Haemaphysalislongicornis,and its critical role in host blood feeding[J].International Journal for Parasitology,2007,37(3-4):383-392.

[35]LIU Y,CAI D,WANG L,et al.Glucosamine:fructose-6-phosphate amidotransferase in the white shrimp Litopenaeu-svannamei:characterization and regulation under alkaline and cadmium stress[J].Ecotoxicology,2015,24(7):1754-1764.

[36]PENEFF C,MENGIN-LECREULX D,BOURNE Y.The crystal structures of Apo and complexed Saccharomycescer-evisiae GNA1 shed light on the catalytic mechanism of an amino-sugar N-acetyltransferase[J].Journal of Biological Chemistry,2001,276(19):16328-16334.

[37]DYDA F,KLEIN D,HICKMAN A B.GCN5-related N-acetyltransferases:A structural overview[J].Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure,2000,29(1):81-103.

[38]HURTADO-GUERRERO R,RAIMI O G,MIN J,et al.St-ructural and kinetic differences between human and Asperg-illusfumigatus D-glucosamine-6-phosphate N-acetyltransfe-rase[J].Biochemical Journal,2008,415(2):217-223.

[39]MARIÑO K,GÜTHER M,WERNIMONT A K,et al.Char-acterization,localization,essentiality,and high-resolution crystal structure of glucosamine 6-phosphate N-acetyltransferase from Trypanosomabrucei[J].Eukaryotic Cell,2011,10(7):985-997.

[40]WANG J,LIU X,LIANG Y H,et al.Acceptor substrate b-inding revealed by crystal structure of human glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase 1[J].FEBS Letters,2008,582(20):2973-2978.

[41]BANDINI G,MARIÑO K,GÜTHER M L S,et al.Phosp-hoglucomutase is absent in Trypanosoma brucei and redun-dantly substituted by phosphomannomutase and phospho-N-acetylglucosamine mutase[J].Molecular Microbiology,2012,85(3):513-534.

[42]KATO N,MUELLER C R,WESSELY V,et al.Mosquito glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase:cDNA,gene structure and enzyme kinetics[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2005,35(6):637-646.

[43]MIO T,KOKADO M,ARISAWA M,et al.Reduced virule-nce of Candida albicans mutants lacking the GNA1 gene encoding glucosamine-6-phosphate acetyltransferase[J].Micr-obiology,2000,146(Pt 7)(7):1753-1758.

[44]KATO N,MUELLER C R,WESSELY V,et al.Aedesaegypti phosphohexomutases and uridine diphosphate‐hexose pyr-ophosphorylases:comparison of primary sequences,substrate specificities and temporal transcription[J].Insect Molecular Biology,2010,14(6):615-624.

[45]张政,张学尧,张建珍,等.飞蝗磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶基因表达及功能[J].山西大学学报(自然科学版),2019,42(4):929-934.

[46]STROMINGER J L,SMITH M S.Uridine diphosphoacet-ylglucosamine pyrophosphorylase[J].Journal of Biological C-hemistry,1959,234(7):1822-1827.

[47]SZUMILO T,ZENG Y,PASTUSZAK I,et al.Purification to homogeneity and properties of UDP-GlcNAc (GalNAc) pyrophosphorylase[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271(22):13147-13154.

[48]YAMAMOTO K,KAWAI H,MORIGUCHI M,et al.Purifi-cation and characterization of yeast UDP-N-acetylglucosa-mine pyrophosphorylase[J].Agricultural and Biological Che-mistry,1976,40(11):2275-2281.

[49]YAMAMOTO K,MORIGUCHI M,KAWAI H,et al.Purifi-cation and some properties of uridine diphosphate N-acety-lglucosamine pyrophosphorylase from Neurospora crassa[J].Canadian Journal of Microbiology,1979,25(12):1381-1386.

[50]JARROLL E L.Purification and characterization of UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase from encysting Gi-ardia[J].Molecular & Biochemical Parasitology,1998,95(1):135-139.

[51]PALAKA B K,SINGH N P,KOTAPATI K V,et al.UDP-N-Acetyl glucosamine pyrophosphorylase as novel target for controlling Aedes aegypti–molecular modeling,docking and simulation studies[J].Int.J.Mosq.Res,2014,1(4):17-24.

[52]MERZENDORFER H,ZIMOCH L.Chitin metabolism in insects:structure,function and regulation of chitin synthases and chitinases[J].Journal of Experimental Biology,2003,206(24):4393-4412.

[53]LIANG Y-R,LIN C,WANG R-R,et al.Cloning and ex-pression pattern of chitin synthase (CHS) gene in epidermis of Ectropis obliqua Prout[J].African Journal of Biotechnology,2010,9(33):5297-5308.

[54]IBRAHIM G H,SMARTT C T,KILEY L M,et al.Cloning and characterization of a chitin synthase cDNA from the mosquito Aedes aegypti[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2000,30(12):1213-1222.

[55]汪小东,刘峰,袁秀萍,等.二斑叶螨几丁质合成酶(CHS)基因的克隆及序列分析[J].西北农业学报,2014,23(5):39-44.

10.3969/j.issn.2095-1205.2022.05.32

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2095-1205(2022)05-96-05