基于网络药理学及分子对接探讨灵芝的免疫调节机制

覃君良， 苏志恒

免疫是机体自身的防御机制，当免疫功能下降时，机体容易受到致病因子的侵袭。中医认为，人体的免疫功能类似于中医学的“正气”[1]。“正气内存，邪不可干”“邪之所凑，其气必虚”，即虚热、虚寒证表现为免疫系统功能低下，所以“扶正”可通过提高机体免疫能力[2]。中医药治疗因免疫功能低下引起的疾病有着悠久的历史，能多层次、多途径、多靶点地发挥作用，提高机体免疫力以防治疾病[3]。灵芝是真菌门担子菌纲多孔菌目灵芝科灵芝属真菌的干燥子实体。《神农本草经》将灵芝列为有效无毒的“上药”。《中华人民共和国药典》2000年收载灵芝，并在2020年版中规定赤芝或紫芝的干燥子实体为灵芝的正品，且明确灵芝质量控制的指标主要为灵芝多糖。灵芝具有补中益气、扶正固本、滋补强壮的功效[4]，体现了中医药“整体观”的治疗思路。随着分子生物学、免疫学研究的不断深入，中药调节机体免疫的作用机制得到了更加广泛的重视和更深入的认识。现代药理学研究发现，灵芝中含有化学成分200多种，目前研究比较广泛是多糖、三萜类、肽聚糖等[5]。灵芝不仅能增强机体非特异性免疫，对特异性免疫也有一定的作用效果[6]，但其潜在的作用机制还未得到详细的阐明。网络药理学的概念由Hopkins[7]于2007年第一次提出，旨在应用组学分析、高通量筛选、可视化网络和网络分析等多种技术，整体、系统、全面地研究药物小分子和疾病之间的关系，揭示“药物-靶点-疾病”之间复杂的网络关系。鉴此，本研究应用网络药理学的方法，对灵芝的有效成分、治疗靶点、信号通路进行分析，为后续临床应用和基础研究提供参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1灵芝活性成分及靶点筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为有效成分的筛选条件，以“灵芝”为关键词，查询并筛选该数据库中所包含的灵芝有效活性成分。数据库资料搜索时间截至2021年10月。应用Pub-Chem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找筛选得到的活性成分的SMILES格式并保存。活性成分的作用靶点通过Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)以SMILES文件为模板进行靶点预测，导出结果并保存。把Swiss Target Prediction数据库预测的结果中可能性>0.1的靶点与TCMSP数据库预测得到的靶点整合，并去除重复靶点，应用UniProt数据库(https://www.uniprot.org)把预测得到的靶点名称统一校正为官方名称，获取最终预测的活性成分潜在靶点信息。

1.2免疫调控相关靶点筛选 以“immunity”“immune”“immuno”为关键词，分别在GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(https://omim.org)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/)、TDD(http://db.idrblab.net/ttd/)数据库筛选免疫调控相关靶点，并限定物种为人类。将上述5个数据库的检索结果合并，去除重复靶点，并将靶点基因导入Uniprot数据库进行基因标准化整理，最终获得免疫相关的靶点。

1.3药物-活性成分-作用靶点-疾病网络图绘制 通过在线画图工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)构建成分潜在靶点与免疫相关疾病靶点的韦恩图，分析活性成分与免疫调控的共有靶点，并导入到Cytoscape 3.8.0软件中绘制药物-活性成分-作用靶点-疾病网络图。

1.4核心蛋白的收集 将灵芝和免疫共有靶点导入String数据库(https://string-db.org)，限定物种为人类，获取蛋白相互作用关系，结果以TSV格式导出，筛选结合率评分≥0.9的作用靶点蛋白，并导入Cytoscape软件构建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络，计算拓扑学参数，包括度、介度和紧密度。

1.5基因的富集分析 以度、介度和紧密度≥中位数为筛选标准，将筛选得到的核心蛋白应用R软件对获得的基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。

1.6活性成分与关键靶点的分子对接验证 在TCMSP数据库下载灵芝活性成分结构mol2格式，作为小分子化合物库。在PDB数据库中下载重要潜在靶点蛋白质的三维结构pdb格式，作为受体库。用SYBYL-X2.0软件进行分子对接。

2 结果

2.1灵芝的靶点 在TCMSP数据库中检索到灵芝242个活性成分，经过OB和DL参数初步筛选后共获得61个活性成分，剔除18个未查询到靶点的活性成分，最终获得43个活性成分，见表1。将TCMSP和Swiss Target Prediction两个数据库的预测结果进行整合，删掉重复，得到43种活性成分的499个潜在靶点。

表1 灵芝中的活性成分

续表1

2.2免疫相关靶点 将GeneCards、DrugBank、OMIM、PharmGKB、TDD 5个数据库对免疫靶点的预测结果进行整合去重，得到靶点12 454个，将免疫相关基因与药物靶点基因映射筛选出共同靶点483个，确定为灵芝调节免疫的靶点基因。见图1。

图1 免疫靶点与药物靶点韦恩图

2.3药物-活性成分-作用靶点-疾病网络图 应用Cytoscape 3.8.0软件对灵芝调控免疫的483个潜在靶点构建活性成分-靶点网络，见图2。其中，度值排名靠前的活性成分有赤芝醛B(度值=100)、环氧灵芝醇B(度值=100)、甲基灵芝酸DM(度值=100)和(+)-丹芝酸甲酯A(度值=100)。

共有525个节点，构成2 604条相互作用关系

2.4核心蛋白PPI网络构建 将筛选得到的483个共同靶点导入String数据库构建PPI网络图，共有353个节点，2 693条边。见图3。度值排名前10的核心靶点见表2。

表2 度值排名前10的核心靶点

每个节点(node)代表1个靶点，边(edge)代表靶点之间存在相互作用关系。根据度值(degree)的大小设置节点大小；综合分数(combined score)越大，边线颜色越粗且越深

2.5GO富集与KEGG富集分析 GO分析包括生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、细胞组分(cellular component,CC)，共富集到1 512个BP，包括脂质代谢过程的调节、肽基-丝氨酸磷酸化、肽基-丝氨酸修饰等；147个MF，包括磷酸二酯水解酶活性、二十醛受体活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等；74个CC，包括突触前膜、转移酶复合体/转移含磷基团、小凹等。排名前10位GO分析结果见图4。KEGG通路富集到166条通路，前10位KEGG通路主要包括神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、蛋白多糖与癌症、乙型肝炎病毒、鞘脂代谢通路等。见图5。

图4 GO富集分析结果图

注：AGE-RAGE：晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products)；TRP：瞬时受体电位(transient receptor potential)

2.6分子对接结果 选取PPI网络中度值前2的核心靶点类固醇受体辅助活化因子(steroid receptor coactivator,SRC)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)与相应核心活性成分进行分子对接，对接所需的受体文件从PDB数据库获得[靶点SRC(PDB ID：1O43)、MAPK1(PDB ID：6SLG)]，所有受体文件均做删除原配体、水分子及加氢加电荷处理，配体分子为灵芝活性成分。使用SYBYL-X2.0中Surflex-Dock模块对接，结果显示免疫靶点蛋白SRC、MAPK1与所对应的活性分子具有一定的结合活性。见表3。(+)-丹芝酸甲酯A与SRC，赤芝酸甲酯F与MAPK1的分子对接可视化结果见图6。

表3 活性成分与受体蛋白的分子对接得分

图6 活性成分与受体蛋白的分子对接可视化结果图

3 讨论

3.1灵芝具有广泛的药理活性，目前已有许多产品被批准作为药物和保健食品上市，用于防病治病和养生保健[8]。与西药相比，灵芝作为中药材其化学成分更复杂，作用机制也尚未得以阐明。本研究应用TCMSP数据库资料进行分析，结果显示灵芝的潜在活性成分有43个，包括三萜类(34个)、甾醇类(8个)、萜醇类(1个)。有研究发现，灵芝三萜类化合物具有增强免疫的功效[9]，其机制可能与促进T淋巴细胞活化[10]、直接刺激树突状细胞增殖[11]和抑制单核/巨噬细胞的吞噬功能[12]有关。此外，灵芝三萜还可以通过调节T细胞亚群分化改善鼻咽癌小鼠的免疫功能[13]，通过抑制一氧化氮生成对小鼠的免疫性肝损伤起到保护作用[14]。进一步的研究发现，灵芝三帖类化合物中的灵芝酸也显示出良好的免疫调节作用[15]；通过下调细胞因子分泌，降低肝组织中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，进而减少免疫性肝损伤[16]。Wu等[17]研究发现，灵芝孢子油在小鼠体内具有免疫增强特性，而田丹妮[18]认为，含量丰富的灵芝三萜类化合物是灵芝孢子油发挥免疫调节作用的主要原因之一。此外，灵芝中的其他成分也具有良好的免疫调节作用，如灵芝多糖[19]、灵芝蛋白[20]等。

3.2本研究PPI网络结果显示，灵芝调控免疫的关键靶点主要涉及SRC基因、MAPK1、肿瘤蛋白53(tumor protein 53,TP53)、丝裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)、信号转导和转录活化因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)等。其中，SRC激酶为SRC家族激酶的一员，是免疫受体信号转导的重要调节因子，在髓系免疫细胞和B淋巴细胞中启动促炎和抑制信号通路[21]。研究发现，SRC激酶抑制剂达沙替尼可通过抑制NK细胞[22]、CD4+T细胞和幼稚T细胞[23]而发挥调节机体免疫的功能；同时，也可作为免疫抑制剂用于CAR-T治疗[24]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与机体的免疫调控密切相关[25]。Wang等[26]研究发现，肿瘤逃逸的新机制可能是肿瘤诱导的树突状细胞经MAPK激活和细胞外信号调节激酶(extracellular regulated kinase,ERK)抑制实现。Wilmott等[27]发现，联合使用MAPK和免疫检查点抑制剂，可降低MAPK诱导的免疫抑制，增强宿主免疫应答，且临床研究初步表明，MAPK抑制剂可以大幅度提高免疫原性敏感度，提高患者对程序性死亡受体1(programmed cell death receptor 1,PD1)免疫治疗的应答率和持续时间。最近有研究还发现，MAPK抑制剂联合放射治疗可协同增强免疫检查点的封锁，从而提高抗肿瘤疗效[28]。鉴此，笔者认为灵芝可能也是通过影响SRC、MAPK1等蛋白的表达而发挥免疫调控的作用。

3.3本研究GO富集结果显示，灵芝调控免疫功能主要涉及磷脂代谢调节、肽基-丝氨酸磷酸化和肽基-丝氨酸修饰等生物学功能，而且每种生物学功能与靶点的作用都是一个复杂生物学网络系统，同时也能说明灵芝调控免疫的机制并非局限于单一靶点或生物功能。KEGG通路富集分析发现，神经活性配体-受体相互作用、cAMP信号通路、蛋白多糖与癌症、乙型肝炎病毒、鞘脂代谢通路等通路直接或间接参与免疫的调控。分子对接结果提示，SRC、MAPK1能与(+)-丹芝酸甲酯A、赤芝酸甲酯F形成稳定结合[29]。

综上所述，本研究采用网络药理学和分子对接的方法确认了灵芝调控免疫的活性成分、关键靶点和信号通路，并基于分子对接初步模拟其可能的分子作用机制，为灵芝对免疫的调控作用机制研究提供了理论依据和线索。但研究结论尚需通过生物实验和临床试验进一步验证。