聚乳酸羟基乙酸-甲状旁腺激素相关蛋白复合微球的制备 形态表征及生物相容性研究

刘金晶， 周强强， 龙桂月， 黄 臻， 廖红兵

随着生物制药和生物医学的快速发展，生物活性大分子治疗发展迅速，而如何将生物活性大分子安全有效地运载至体内，并保持有效浓度，是其临床应用的主要挑战之一。理想的生物活性大分子运载系统需具备以下性能：(1)良好的生物相容性；(2)生物可降解性；(3)非免疫原性[1]。聚乳酸羟基乙酸(polylactide-co-glycolide，PLGA)是一种常用的高分子可降解聚合物，在水环境内，聚合物的酯键水解，每个水解酯键形成一个羟基和一个羧基。酯键水解导致聚合物长链被切断，增加PLGA的亲水性，更易形成水溶性碎片。最终，这些水溶性碎片降解成为乳酸和乙醇酸，可进一步在体内被降解为二氧化碳和水，对机体无毒性[2]。由于PLGA具有优异的生物相容性和生物降解性，已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准为有效的药物传递载体[3-4]。蛋白质可通过包埋和吸附的方式加载到空白PLGA微球内，制成药物缓释体系。除了微球给药体系，另有药物涂层等方式[5]。有研究者设计并成功制备出负载胰岛素的PLGA纳米颗粒，并且PLGA纳米颗粒外覆由5β-胆酸修饰的乙二醇壳聚糖，以此改善胰岛素的口服给药效果[6]。PLGA还能与一些骨替代材料，如羟基磷灰石、磷酸钙类材料复合，以改善骨替代材料的性能[7-9]。甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对骨代谢有双重作用，有研究表明在低浓度剂量作用下，PTHrP能促进骨生成，而在高浓度作用下则会引起破骨效应[10]。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)具有良好的生物相容性、骨诱导性、骨传导性、自凝性以及可注射性，但是其降解效率低，材料凝固后内部缺少孔隙，这使得CPC的降解速率与新骨生成速率不匹配[11-12]。将PTHrP装载到PLGA微球[即负载PTHrP的PLGA微球(polylactide-co-glycolide microspheres loaded with parathyroid hormone-related protein,PLGA-PTHrP)]，将其引入CPC内部，得到CPC/PLGA-PTHrP复合材料体系。PLGA降解，PTHrP持续释放以促进CPC的早期降解，在CPC内部形成分散的孔隙，促进早期成骨[13]。本研究制备PLGA-PTHrP，并观察其在体外的表征、蛋白质释放特点，以及其对大鼠全骨髓细胞的增殖效应影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 聚乙烯醇(poly vinyl alcohol，PVA；四川维尼纶厂)，二氯甲烷(天津大学科威公司)，PLGA(分子量1.3万，羧基末端，50∶50；山东省药学科学院)，PTHrP(美国Protech)，集热式磁力搅拌器(德国IKA)，扫描电子显微镜(德国Zeiss)，冷冻干燥机(上海亿倍实业)，AMEM培养液(美国HyClone)，胎牛血清(澳洲GIBCO)，青链霉素混合液(北京索莱宝有限公司)。SD大鼠购自广西医科大学医学实验动物中心。

1.2实验方法

1.2.1 复乳溶剂挥发法制备空白PLGA微球 2 g PVA中加入100 ml去离子水，放置于集热式磁力搅拌器上，缓慢加热至90 ℃，持续搅拌至PVA完全溶解，制备成2% PVA外相水。取60 mg PLGA于15 ml离心管，转移至通风橱内，加入3 ml二氯甲烷，高速震荡至PLGA完全溶解，制备成20%初乳。向初乳内加入0.9 ml去离子水，高速震荡10 s，将所得溶液快速转移至5 ml注射器内，快速均匀滴加至30 ml 2% PVA外相水中，冰浴下磁力搅拌机8 000 r/min，15 s，制备成复乳。将复乳溶液转移至含270 ml去离子水的烧杯内，置于磁力搅拌机上，500 r/min搅拌4 h，使二氯甲烷挥发。溶剂挥发后，停止搅拌，静置0.5 h，得到白色沉淀物，即为PLGA空白微球。收集白色沉淀于离心管，双蒸水洗涤，室温下4 000 r/min，离心5 min，反复吹打洗涤3次。将收集到的空白PLGA微球在真空冷冻干燥机内冷冻干燥24 h，-20 ℃保存。

1.2.2 PLGA-PTHrP制备 无菌条件下，配制不同浓度的PTHrP溶液，分为：A组，1.5 μg/ml；B组，1.0 μg/ml；C组，0.5 μg/ml。各组蛋白质溶液均为5 ml。称取0.2 g空白PLGA微球，将微球与各组蛋白质溶液混合，震荡混匀，静置30 min，收集微球，冷冻干燥，-20 ℃低温保存。

1.2.3 微球形态观察及粒径测量 取空白PLGA微球制样，扫描电镜下观察微球形态结构，使用激光粒度分析仪测量微球的粒径范围，计算平均粒径。扫描电镜图用Image-Pro Plus软件分析。

1.2.4 PLGA-PTHrP的体外释放检测 根据试剂盒说明书配制BCA工作液，取10 μl的标准品蛋白溶液(5 mg/ml)，生理盐水稀释10倍作为蛋白标准品。分别取标准品0、1、2、4、8、12、16、20 μl加到96孔板内，再分别加入20、19、18、16、12、8、4、0 μl生理盐水，混匀，每孔终体积为20 μl。向各孔内分别加入200 μl BCA溶液，静置1 h。应用酶标仪检测595 nm波长下各孔OD值，绘制蛋白浓度标准曲线。后将200 μg载不同浓度PTHrP的PLGA微球分别浸泡在含1 ml磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)的离心管内，37 ℃恒温摇床振荡，并于1 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d和12 d，分别取20 μl浸提液，应用BCA蛋白定量试剂盒进行检测，根据所得OD值和蛋白浓度标准曲线计算PTHrP浓度，并绘制蛋白累计释放曲线。

1.2.5 PLGA-PTHrP对全骨髓细胞增殖影响的观察

取4～8周龄SD大鼠，以过量麻醉法处死，无菌条件下分离取出股骨、胫骨，去净软组织，储存于PBS溶液(含1%青链霉素双抗)中。移至超净工作台，剪去两端骨骺端，用注射器吸取AMEM培养液(含1%青链霉素双抗)从两端冲出骨髓直至髓腔发白。收集培养液于离心管，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，细胞重悬接种于T25培养瓶，使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，1%双抗的AMEM培养液作为完全培养液，于培养箱中培养16 h，培养条件设置为37 ℃、5% CO2。收集上清液，1 000 r/min离心5 min，弃上清后重悬，重新接种于T25培养瓶中。每2 d换液1次，继续培养3 d。收集细胞，以4×104cells/ml细胞浓度接种至96孔培养板中，每孔100 μl。实验分组：空白对照组(完全培养液)、PLGA微球组(含1 mg/ml空白PLGA微球的完全培养液)、PLGA-PTHrP组(含1 mg/ml PLGA-PTHrP微球的完全培养液)。培养12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d后，每孔加入10 μl，5%的CCK-8溶液，避光培养2.5 h，酶标仪检测记录450 nm波长下各孔OD值。

2 结果

2.1PLGA微球形态观察和粒径检测结果 在200倍镜下，PLGA微球呈球形或类球形，分散均匀。500倍镜下，可见微球表面较规则平整，有些微球呈现为多孔状。随机选择300个微球，经激光粒度分析仪测算，微球的平均粒径为(56.73±7.22)μm。见图1～2。

ⓐ200×；ⓑ500×；ⓒ1 000×；ⓓ1 000×

图2 PLGA微球粒径分布图

2.2PLGA-PTHrP体外释放检测结果 在前100 h，各组载蛋白微球的蛋白释放速率较高，蛋白释放量达到蛋白总量的63.1%。随后进入释放平缓期，总缓释时间达到300 h。至缓释结束，蛋白释放量达总量的87.3%。见图3。

图3 PLGA-PTHrP的PTHrP累计释放量变化图

2.3PLGA-PTHrP对全骨髓细胞增殖活性的影响

CCK-8检测结果显示，在细胞接种后第1天，三组细胞均无明显的增殖现象，随后细胞进入指数生长期，增殖速度明显升高。到第7～9天时，细胞增殖速度减缓。三组细胞的增殖情况无显著差异。见图4。

图4 三组不同时间点OD值变化图

3 讨论

3.1微球研发的历史可追溯至20世纪末期，按构成微球的成分可将其分为有机聚合物微球和无机微球。本研究所制微球属于有机聚合物微球。构成有机聚合物微球的有机聚合物主要包含蛋白类高分子聚合物，如明胶、白蛋白、多糖类高分子聚合物以及合成类高分子聚合物等[14]。明胶是一种天然高分子蛋白，具有良好的生物相容性和降解性。在医学方面，明胶微球常用于药物缓释、栓塞治疗、体内示踪和组织工程等方面；在药物缓释方面，明胶微球的体外药物释放率与明胶微球的溶胀率有关。有学者制备了与更昔洛韦交联的明胶微球，其体外药物释放与明胶和药物的比例有关，明胶和药物的比值越高，释放越慢，药物突释效应越小[15]。壳聚糖中含有大量的氨基和羟基，是天然碱性多糖，有良好的生物相容性、可降解性，故壳聚糖在组织工程、药物递送、药物缓释等方面广泛应用。壳聚糖常与明胶制备成明胶-壳聚糖复合微球，常作为组织工程的支架。有研究分别制备了包裹双氯酚酸钠的明胶微球、壳聚糖微球和明胶-壳聚糖复合微球，体外释放实验结果显示复合微球的前期药物突释情况、释药时间以及药物释放量优于单一微球[16]。PLGA等合成高分子聚合物成球性好，化学性质稳定，能稳定地释放装载在微球里的药物等活性物质，释放速率对药物性质的依赖性较小[17]。PLGA微球制备方法包括复乳溶剂挥发法、喷雾干燥法、相分离法、微流体法、膜乳化技术等。喷雾干燥法制得微球的药物包封率较高，生物活性好，而微粒容易黏附在喷雾干燥器的内壁，对于热敏性高的药物，则不适用该方法。相分离法制备过程复杂，对搅拌方式、搅拌速度、有机溶液种类、有机溶液浓度、萃取液等因素都有严格的要求，同时对载药微球的粒径、形态、药物包封率等有显著影响[18-19]。膜乳化技术制备的微球尺寸均一，条件可控，能制备小粒径的载药微球，但是微球生成的速率较缓慢[20]。复乳溶剂挥发法是制备载蛋白以及肽类药物微球的金标准。该法简单易行，能在一定程度上控制微球粒径，但是在封装蛋白质等大分子时，蛋白质分子在水-有机物介质表面容易发生结构不稳定，有可能会造成结构展开或者聚集。目前主要通过添加血清白蛋白、糖类等赋形剂来维持蛋白质分子的结构稳定[21]。

3.2在以上几种微球类型以及制备方法中，经综合考虑设备要求、制备工艺、操作可行性以及装载药物类型，本课题组选择复乳溶剂挥发法制备微球。结果显示，所得PLGA微球的尺寸均匀，形态规则，且最终制得的PLGA-PTHrP微球在体外实验中显示出较好的缓释效应。CCK-8实验表明，与空白对照组相比较，空白微球和载蛋白微球共培养细胞的增殖效应并未受到抑制，提示PLGA微球和载蛋白浓度为1.5 μg/ml的微球对大鼠全骨髓细胞没有毒性，生物相容性好，可用于后续实验研究。PTHrP可以通过上调核因子-κB受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)表达，促进破骨前体细胞向破骨细胞分化，促进骨吸收。本课题组的前期研究发现，PLGA作为致孔剂制备的CPC/PLGA复合材料在植入体内4周可观察到破骨样细胞首先对PLGA微球进行吞噬消化，在CPC基质内部形成孔隙，后期形成的新骨与微球降解前的形态一致，呈骨球状[7]。本课题组将PTHrP负载于PLGA微球内制备得到PLGA-PTHrP，其创新点在于PLGA既作为蛋白载体也作为一种致孔剂，后续工作把该复合微球引入骨替代材料(如CPC内部)，期望通过PLGA的早期降解以及PTHrP的局部释放促进破骨活动，以加速CPC的早期降解，弥补其降解速度与新骨生成速度不匹配的缺点。

3.3但是，本实验也有一些不足之处：PTHrP在初期有蛋白突发释放的现象，各组载蛋白PLGA微球在前100 h内蛋白的释放速率较快，释放量达到蛋白总量的63.1%。关于如何解决药物突发释放问题，仍是目前载药系统研发的难点之一。药物的释放一般可以分为初始突发释放、滞后时间、侵蚀加速释放三个阶段[22]。药物的突发释放与PLGA微球表面的弱结合以及吸附分子有关，该阶段不利于药物的持续释放。为了解决药物的突发释放问题，目前的研究主要集中在改进制备微球的配方以及对负载药物的修饰上。在制备过程中可以缩短溶剂蒸发时间或选择无毒的有机溶剂。此外，还有研究者制备载艾塞那肽的卵磷脂纳米粒，再将纳米颗粒封装进PLGA微球内，结果显示，封装纳米颗粒的PLGA微球初始突发释放明显减少[23-24]。

综上所述，本研究成功制备了负载有效浓度PTHrP的PLGA微球，但只探索了其在体外的缓释效应以及其对细胞增殖效应的影响，还需进一步验证该载药系统的生物相容性，并进行动物实验以验证其在体内的缓释效应。