天然药物抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

叶 泥 ， 颜其贵 ， 王 彬

(1.贵州大学动物科学学院 ， 贵州 贵阳 550025 ； 2.四川农业大学动物医学院 ， 四川 成都 611130)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称“猪蓝耳病”，主要临床表现为发热、呼吸困难、耳部皮肤发绀、厌食，怀孕母猪发生流产、产死胎、弱仔、木乃伊胎等。根据基因序列的差异，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)可以分为2个基因型：欧洲Ⅰ型和北美Ⅱ型，两者同源性在60%左右，我国流行株主要属于北美Ⅱ型。目前，我国在防控该病过程中主要以疫苗预防为主，药物治疗效果往往不佳。中药作为天然药物的代表，在治疗新型冠状肺炎中疗效十分显著，充分显示天然药物在抗病毒中的巨大潜力。天然药物具有药效不易丧失、耐药性产生较少、副作用较小等特点，部分天然药物还有提高机体免疫力的优点，其抗病毒作用不仅体现在直接作用于病毒上，还能增强机体免疫力，保护机体免受病毒损害。中药在我国有悠久的历史，经历此次新冠疫情后，天然药物研究受到了极大的重视，在天然药物抗PRRSV的研究中，以体外细胞试验和猪日粮中添加药物试验为主，目前选用的细胞主要是非洲绿源猴肾细胞(Marc-145细胞)和猪肺泡巨噬细胞(3D4/2细胞)，本文对部分抗PRRSV天然药物的研究进行了整理，希望能为寻找抗PRRSV的新型兽药提供参考。

1 天然药物在Marc-145细胞上抵抗PRRSV感染的作用

1.1 葛根连芩提取液抗PRRSV的作用 葛根芩连汤最早出自《伤寒论》，是经典古方之一，主要成分是葛根、甘草、黄芩和黄连，原主治邪热下痢，在现代医学应用中已远超原方之治。在治疗细菌性痢疾[1]、轮状病毒感染[2]、糖尿病等[3]方面都有良好的效果，此外，通过网络药理学分析提示该方对治疗新型冠状肺炎也有一定效果[4]。汪志等[5]在Marc-145细胞上研究葛根连芩提取液抗PRRSV的作用，结果发现葛根连芩提取液1∶250和1∶500倍稀释时，对PRSSV的阻断作用明显，但所有设置的稀释倍数对PRRSV的抑制作用不理想，推测该药通过与细胞膜作用，减弱病毒与受体的结合能力，增强了细胞对PRRSV的抗感染能力。单独使用葛根芩连汤的部分成分提取物对抗PRRSV依然具有效果，曾强等[6]研究甘草粗提物对PRRSV 突变株(PRRSV PX)感染Marc-145细胞的作用中发现，在最大安全质量浓度下，甘草粗提物能阻断、抑制和直接杀灭PRRSV PX(质量浓度分别为3.125、0.319 g/L和0.782 g/L)，同时对Marc-145细胞分裂增殖有促进效果，且最佳质量浓度与试验中板蓝根和鱼腥草粗提物浓度一致，都为1.563 g/L，这可能与提取物中的未知生长调节因子有关。甘草酸是甘草的主要作用成分之一，胡安君等[7]在体外用Marc-145细胞研究发现，甘草酸阻断PRRSV感染是通过减少PRRSV GP4的表达，降低细胞CD163和CD151受体的表达来实现的。CD163是PRRSV感染的主要受体，介导病毒内化和宿主细胞中病毒核酸的释放，能与PRRSV的重要包膜蛋白GP4在脂筏内相互作用[8]，介导病毒入侵细胞。冼琼珍等[9]研究发现，黄连、黄芩水提物对Marc-145细胞的最大安全浓度均为1.56 mg/mL，2种药物对PRRSV的抑制作用最显著，直接杀灭作用次之，阻断作用相对较弱。药物抑制作用(先加病毒后加中药)的机理可能是病毒先入侵了细胞并产生破坏，后加入的中药干扰了细胞内病毒的复制，抑制病毒增殖和释放；直接杀灭作用(中药与病毒同时加入)则同中药的生物活性成分与病毒直接结合破坏病毒结构或与药物干扰病毒RNA和蛋白质的合成有关；阻断作用(先加中药后加病毒)中细胞先与药物作用，可能是药物中的多糖、黄酮类等活性成分增强了细胞膜的稳定性，使细胞避免了受病毒的吸附而得到保护，提高了细胞抗病毒感染的能力。

1.2 龙胆草、苦参碱抗PRRSV的作用 中药成分复杂，需明确中药发挥作用的有效成分，才能更好的发展和利用中药。为探究龙胆草总苷、龙胆草总黄酮及龙胆草水提物在体外抗PRRSV的作用，以Marc-145细胞为体外模型，利巴韦林为阳性对照，发现龙胆草总苷、龙胆草总黄酮及龙胆草水提物对病毒的阻断、抑制和直接杀灭作用分别为33.4%、78.2%、81.9%；66.1%、41.1%、42.7%；43.1%、57.4%、56.4%，龙胆草总苷的抑制和直接杀灭作用高于龙胆草总黄酮、龙胆草水提物和阳性对照利巴韦林。综合阻断、抑制和直接杀灭作用的结果，龙胆草总苷抗PRRSV效果较佳，其次是龙胆草水提物和龙胆草总黄酮[10]。秦枫等[11]运用同样的研究方式得出半边莲水提物、半边莲总黄酮和半边莲总生物碱都具有体外抗PRRSV的作用，其中，半边莲总黄酮抗PRRSV的效果最好，半边莲水提物的效果最差。苦参是我国传统药物之一，其主要活性成分为苦参碱，苦参碱具有抗炎、抗皮肤纤维化、抗免疫抑制等作用，氧化苦参碱能改变细胞受体和干扰细胞内核酸的合成[12]。赵昕等[13]用Marc-145细胞于体外研究苦参碱对PRRSV的复制抑制、阻断吸附和直接杀灭作用时，发现苦参碱的最大安全浓度为750 mg/L，在安全浓度范围内对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制率达到93.6%，直接杀灭作用的最高抑制率大于95%，表明苦参碱在体外有抗PRRSV的作用和对PRRSV有直接杀灭作用，但不能阻断PRRSV对Marc-145细胞的吸附。孙盼盼等[14-15]对苦参碱抗PRRSV的机制进行了探索，发现在PRRSV感染Marc-145细胞24 h内，苦参碱能显著降低该病毒N基因的表达，并且在病毒感染Marc-145细胞的不同时间通过抑制不同细胞受体的表达来抑制PRRSV吸附和入侵宿主细胞，从而持续性抑制PRRSV在细胞中的复制，此外，还发现苦参碱不是通过抑制ERK1/2信号通路的激活来发挥抗PRRSV作用的。在研究不同苦参碱和甘草酸组方对PRRSV的作用时发现，两者按质量比1∶4，组方药物质量浓度为0.25 mg/mL时，效果最好且使用最安全，增殖抑制和直接杀灭PRRSV的Marc-145细胞病变抑制率分别为76.95%和83.25%[16]。此外，人参多糖、牛蒡苷元、辣蓼黄酮正丁醇在体外Marc-145细胞中对PRRSV都有一定的阻断、抑制和直接杀灭作用。

1.3 板蓝根、黄芪抗PRRSV的作用 板蓝根具有清热解毒、凉血消肿的功效，板蓝根多糖是其主要作用成分，具有抗病毒和促进免疫等功能。早年的研究证实，板蓝根对PRRSV有明显的阻断和抑制作用。王学兵等[17]用水煮醇沉法提取板蓝根多糖，观察其在体外对PRRSV的作用效果，发现阻断和抑制效果较好，最小阻断浓度为2.094 μg/mL，最小抑制浓度为8.375 μg/mL。梅春升[18]在Marc-145细胞上综合评判了12种中药的安全浓度及与猪γ干扰素联合用药抗PRRSV的效果，结果显示黄芪、黄芩和板蓝根的治疗指数位于前三，且它们分别与重组的猪γ干扰素联合用药时具有明显的协同作用。刘樱等[19]的研究发现，黄芪及其提取物具有较强的抗PRRSV的作用，研究板蓝根、黄芪和青蒿及其提取物体外抗PRRSV作用时发现，在最大安全浓度的基础上，3种中药单方中黄芪的阻断作用和直接杀灭作用最强，都能达到100%的保护率；中药提取物中板蓝根多糖对PRRSV的阻断作用最强，青蒿素最差，抑制试验中三者作用相当，但板蓝根多糖对病毒不具有直接杀灭作用，综合3种作用方式得出，3种中药单方中黄芪效果最好，青蒿最差，提取物中黄芪多糖抗PRRSV作用最好，板蓝根多糖最差。

2 天然药物在3D4/2细胞上抵抗PRRSV感染的作用

目前认为，PRRSV感染的原发性靶细胞是猪肺部巨噬细胞，巨噬细胞通过直接吞噬和分泌淋巴因子而在非特异性免疫中起着十分重要的作用，PRRSV感染后机体会出现免疫抑制，有利于病毒在宿主体内的传播，且在猪中能发生持续性感染。梁亚俊[20]从金银花、连翘和板蓝根中分别提取有效成分绿原酸、连翘酯苷A和表告依春，研究以上有效成分对PRRSV感染3D4/2细胞的抑制效果，绿原酸、连翘酯苷A和表告依春的最大安全浓度分别为250、125 μg/mL和1 000 μg/mL，在最大安全浓度下都能增加3D4/2细胞TNF-α和IL-6的分泌并抑制IL-10的分泌；绿原酸和连翘酯苷A还能增强细胞的吞噬能力[20]。宿主在感染PRRSV后，具有抗病毒活性的TNF-α的表达被PRRSV抑制[21]，IL-6具有多种免疫调节作用和干扰素样活性，能抑制病毒和抗肿瘤，PRRSV感染的病猪外周血液中的IL-6表达水平会增加[22]，IL-10能抑制巨噬细胞分泌促炎性细胞因子，造成PRRSV复制和持续感染[23]。加入绿原酸、连翘酯苷A和表告依春后，以上细胞因子表达量都向有利于细胞存活方向发生了改变，增强了细胞的非特异性免疫，此外，绿原酸、连翘酯苷A和表告依春还具有直接灭活PRRSV和抑制PRRSV引起的细胞凋亡的作用[20]。

3 天然药物抗PRRSV的猪体内试验

1996年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次从国内的疑似猪繁殖与呼吸综合征病例中分离出PRRSV。2006年，我国暴发了大范围的高致病性蓝耳病，养猪业损伤严重。目前，仍没有针对该病的特效药，天然药物抗PRRSV和提高宿主免疫力的研究中已有部分进入猪体内试验阶段。吴小萍等[21]用PRRSV攻毒健康仔猪后，用姜黄素拌料饲喂仔猪，发现姜黄素不能降低PRRSV感染引起的温度升高，也不能诱导抗PRRSV特异性抗体的显著升高，但能诱导特异性淋巴细胞增殖，攻毒21 d后可显著降低病毒血症水平，显示姜黄素对抑制仔猪体内的PRRSV有一定的作用，也有体外试验证实姜黄素是通过诱导血红素加氧酶-1的表达来抑制PRRSV复制的[22]。王惠[23]使用PRRSV弱毒苗免疫后备母猪后，饲喂板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖、板青颗粒配合黄芪多糖，研究其对免疫抗体的影响，30 d后检测血液发现，板蓝根颗粒配合黄芪多糖作为免疫调节剂效果明显，能稳定抗体水平，降低散毒风险；板蓝根颗粒、板蓝根颗粒配合黄芪多糖能有效降低血液中PRRSV的核酸载量。多个天然药物的提取成分对猪繁殖与呼吸综合征疫苗有免疫增强作用，如板蓝根多糖、黄芪多糖、白花蛇舌草多糖、山药多糖和马尾藻多糖。严安毓[24]将黄芪多糖、银黄可溶性粉和板蓝根颗粒科学配伍后添加于饲料中给各阶段猪食用，发现其可明显降低仔猪血液、母猪脐带血和公猪精液中的带毒率，降低仔猪发病率及促进保育仔猪生长和发育。刘洋[25]、田春雷[26]、袁威[27]在对复方中药“猪康散”(主要成分为金银花、连翘、板蓝根、黄连、黄芪、黄柏、大黄、白芍、石膏、知母、栀子、甘草)的研究中发现，其在人工感染PRRSV的仔猪体内抗PRRSV的作用表现在如下方面：促进淋巴细胞增殖，减少凋亡，提高机体细胞免疫能力；提高血清和组织抗氧化功能，以清除自由基、改善机体功能，提高抗PRRSV的能力；明显提高血清中免疫球蛋白和细胞因子水平，增强机体特异性免疫功能，而达到抗PRRSV的作用。除猪体内试验外，蔡丙严等[28]通过给SD大鼠饲喂野大黄，分离其含药血清，用于研究含药血清在体外对PRRSV的抑制作用发现，含野大黄的血清有抑制和直接杀灭PRRSV的功效。

近些年，通过体外和体内研究中药/复方/中兽药制剂对PRRSV作用的研究较多，如冼琼珍等[9,29]先后研究了26种中药对PRRSV的阻断、抑制、直接杀灭作用，表1中整理了部分抗PRRSV的药物。

表1 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的有效中药/复方/中兽药制剂

4 展望

我国天然药物资源丰富，同时也是中药的发源国，可作为抗病原微生物天然药物的筛选库，在许多著作中都有应用天然药物预防和治疗人和动物疾病的记录。在探索天然药物治疗猪繁殖与呼吸综合征的过程中，虽然已经发现多种药物有抗PRRSV和提升机体免疫力的作用，但中药的成分复杂，有效成分、抗PRRSV机制、配伍禁忌、最佳剂量等资料尚不全面，皆可作为今后研究的方向。