蛋种鸡源沙门菌分离与生物学特性

郭家媚 ， 赵允清 ， 邵明珠 ， 吴同垒 ， 张志强 ， 李蕴玉 ， 张艳英 ， 李佩国 ， 张召兴,2

(1.河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室 ， 河北 秦皇岛 066004 ； 2.河北旅游职业学院畜牧兽医系 ， 河北 承德 067000)

禽沙门菌病 (Avian salmonellosis)是危害养鸡业的主要细菌性疾病之一，临床中常见沙门菌病主要包括鸡白痢、禽伤寒和鸡副伤寒3种[1-2]。禽沙门菌病可以引起不同日龄的鸡发病，其中雏鸡发病率和死亡率均较高，成年鸡多为慢性和隐性经过，常不出现症状，但可导致生产性能下降，引发其他疾病[3-5]。沙门菌寄生于人和动物的肠道内，绝大多数对人和动物具有致病性，且成为禽产品污染的主要来源之一[6]。相关研究表明，沙门菌引起的中毒病例约占细菌性食物中毒的40%，该菌在自然界中广泛存在，且对人类的健康具有很大的威胁，成为公共卫生问题[7]。

沙门菌属型复杂，其中菌体表面脂多糖、鞭毛抗原分别携带的O、H抗原等，抗原结构复杂，且不易分型，生化反应、血清型分型及传统的分型方法存在较大的局限性[8]。传统的分型方法不能满足区分不同来源的沙门菌菌株之间同源性。脉冲场凝胶电泳技术(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)具有重复性好、分辨率高、易于标化等优点，被广泛应用于细菌分子分型中[9-10]。本试验从患病蛋种鸡体内分离到了12株沙门菌，并对分离的12株沙门菌致病性、血清分型、分子分型等生物学特性进行鉴定，为进一步分析蛋种鸡源沙门菌及开展分子流行病学溯源提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 秦皇岛地区蛋种鸡养殖场，采集患病蛋种鸡的肝脏、卵黄、心血等病料组织。

1.2 主要试剂 沙门菌血清因子，购自中国兽医药品监察所；API 20E试剂盒，购自法国梅里埃生物科技公司；沙门菌科玛嘉培养基、肉汤培养基，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；2×TaqMasterMix、10×M Buffer、0.1%BSA、限制性内切酶XbaⅠ、细胞悬浮缓冲液(CSB)、细胞裂解缓冲液(CLB)、TE缓冲液、20%十二烷基硫酸钠，均购自宝生物工程(大连)有限公司；DL-2 000 DNA Marker，购自北京中科瑞泰生物科技有限公司；沙门菌H9812(Marker)、7%绵羊脱纤血培养基，均由河北省预防兽医学重点实验室提供。

1.3 主要仪器 PCR仪FGEN02TD型，英国Techne公司产品；CHEF MAPPER脉冲场凝胶电泳仪、Bio-Rad型凝胶成像系统，美国Rio-Rad公司产品；生物培养箱DHP-9082型，上海一恒科技有限公司产品。

1.4 试验动物 种蛋由河北科技师范学院动物科技学院动物生产实训基地提供，1日龄白来航雏鸡由本实验室孵化，饲养至14日龄，经检测无沙门菌感染，再进行致病性试验。

1.5 细菌的分离与培养 采集的患病蛋种鸡的肝脏、卵黄、心血等病料组织无菌条件接种于7%绵羊脱纤血培养基，37 ℃恒温培养12～18 h，挑取优势单个菌落接种于沙门菌科玛嘉培养基进行鉴别培养，挑取沙门菌科玛嘉培养基单个菌落，接种于营养肉汤中进行纯化培养后进行染色镜检。

1.6 API 20E试剂盒鉴定 取分离纯化的疑似沙门菌的菌株，按照试剂盒说明书将分离菌株悬浮液接种API 20E试条，37 ℃培养18～24 h后，根据细菌编码表判读结果。

1.7 细菌的PCR鉴定 按细菌提取试剂盒说明书提取基因组DNA，设计16S rRNA基因序列通用引物F:5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/R:5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，进行PCR检测，将分离菌株的PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果与GenBank中登录的沙门菌参考株的基因序列进行同源性比对。

1.8 致病性试验 参考文献[11]报道的方法，分别设攻毒组和对照组，每一株菌为1个攻毒组，将分离菌株培养至对数期计数，每一株分离菌株腹腔注射5只试验雏鸡，剂量为0.2 mL(108CFU/mL)；对照组给予等量的无菌PBS。攻毒12 h后开始观察，试验期为7d，试验期间观察并记录雏鸡发病和死亡情况，对死亡的雏鸡进行细菌分离鉴定。

1.9 血清分型检测 按照沙门菌血清因子说明书，采用玻板凝集试验对分离的12株沙门菌进行血清型鉴定。

1.10 PFGE分型检测 参考文献[8-9]报道的方法，对分离的12株沙门菌进行PFGE分型，用凝胶成像分析系统在紫外灯下获取凝胶图像，将获得的凝胶图像送中国疾病预防控制中心传染病所腹泻病室进行聚类分析。采用BioNumerics软件绘制沙门菌分离株的系统进化树，分析遗传变异性。

2 结果

2.1 细菌的分离与培养 疑似沙门菌分离菌株在7%绵羊脱纤血培养基上长出圆形光滑、边缘整齐、稍隆起、浅白色的菌落，不溶血；在沙门菌科玛嘉培养基上长出圆形光滑、边缘整齐、大小一致的紫红色菌落；革兰染色为阴性的两端钝圆杆状菌，大小(0.5～0.8)μm×(1.0～2.0)μm。

2.2 API 20E生化鉴定 利用API 20E 试条对12株分离菌株进行鉴定，结果显示，12株分离菌株均为沙门菌，并命名为C1、36、C13、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11和C12。

2.3 细菌的PCR鉴定 结果如图1所示，分离的12株分离菌株用细菌的16S rRNA基因序列通用引物均扩增出1 492 bp左右的目的基因。12株分离菌株PCR产物测序结果与GenBank中登录的12株沙门菌参考株的基因序列同源性在97.9%～99.0%。

图1 沙门菌分离菌株的PCR扩增

2.4 致病性试验 攻毒组的白来航雏鸡在攻毒后24～96 h出现精神沉郁、采食量减少、腹泻，个别的雏鸡出现无症状死亡。无菌采集死亡雏鸡的病料组织，成功分离到沙门菌。直到7 d试验结束，对照组白来航雏鸡未出现明显临床症状。经统计分析，12株分离株对白来航雏鸡具有一定致病性，均为致病性沙门菌。致病性试验结果表明，分离的12株沙门菌致病性没有差异性。

2.5 血清分型检测 采用玻板凝集试验对分离的12株沙门菌进行血清型鉴定，结果显示，除菌株36未测出血清型外，其余11株沙门菌分离菌株属于4个血清型，其中菌株C1为O4(B)群无动力沙门菌；菌株C3、C4为鸡沙门菌；菌株C5、C6、C7、C8、C9为病牛沙门菌；菌株C10、C11、C12为肠炎沙门菌。

2.6 PFGE分型检测 用PFGE对12株沙门菌分离菌株进行分子分型，结果如图2所示，12株沙门菌用限制性内切酶XbaⅠ酶切后进行PFGE电泳，其中菌株36 PFGE带型不明显，其余11株沙门菌株可得出不同的PFGE图谱，每株约产生10～20条电泳带。

图2 沙门菌分离株的PFGE图谱

沙门菌聚类分析结果如图3所示，其中菌株36 PFGE带型不明显未进行聚类分析，其余11株分离菌株之间的相似度为56%～100%，11株试验菌可分为5个不同的型别，其中菌株C13、C4与菌株C5、C6、C7、C8相似度均为100%，菌株C9与菌株C10、C11相似度为100%，其余菌株相似度较低。11株沙门菌分离株的聚类分析图中，以75%的相似度为界，可以分为 A、B、C和 D共4个簇。A 簇包括病牛沙门菌和肠炎沙门菌，B 簇均为病牛沙门菌，而C 簇也只有1种血清型，即鸡沙门菌，D簇只有1株沙门菌，血清型为O4群无动力沙门菌。相同的血清型可能具有聚为 1 簇的趋势。不同血清型间的相似度高。菌株C9(病牛沙门菌)和菌株C10(肠炎沙门菌)的相似度为100%，而菌株C8和菌株C9(同为病牛沙门菌)的相似度只有70%。

图3 11株沙门菌分子分型聚类图

3 讨论

沙门菌是一类广泛分布于自然界人兽共患的病原菌之一，该菌可以通过多种途径污染食品、水源及畜产品等，引起人类的食物中毒、急性肠胃炎和动物腹泻等疾病，对人类及动物健康构成极大危害[5-6]。禽沙门菌是一种兼性胞内寄生菌，经过一定途径进入宿主体内，在小肠上皮细胞内定殖，并随着吞噬细胞扩散至其他组织器官，该菌可以通过水平传播，也可以通过垂直传播，带菌和隐形感染的种鸡是沙门菌主要宿主的传染源，可以长期带毒和排毒，导致沙门菌病在种鸡、雏鸡中广泛流行[12-13]。因此，在蛋种鸡养殖过程中应该注意沙门菌病的净化与控制，减少该病的发生与流行。

在养殖过程中，种鸡群鸡白痢净化主要通过全血玻板凝集试验检测，此方法简单便于操作，但只能检出含有 O抗原的沙门菌，会造成其他类型沙门菌感染的漏检，而细菌分离鉴定可以解决其他类型的沙门菌感染的漏检情况[4-6]。本试验采用API20E、PCR和人工感染致病性试验从患病的蛋种鸡病料组织分离得到12株致病性沙门菌，为了更好地控制该病，对其血清分型、分子分型等生物学特性进行鉴定，结果显示，除菌株36未测出血清型外，其余11株沙门菌分离株属于4种血清型，其中 C1为O4(B)群无动力沙门菌，菌株C13、C4为鸡沙门菌，菌株C5、C6、C7、C8、C9为病牛沙门菌，菌株C10、C11、C12为肠炎沙门菌。本试验在患病的蛋种鸡体内分离到病牛沙门菌，国内罕见报道。本试验结果与费中杰[2]、吴晓君[3]、徐耀辉等[4]的报道存在一定差异性，可能与地区分布、鸡的种源、场环境、饲料、鼠类及其他媒介生物携带沙门菌等有关。本试验分离的5株病牛沙门菌可能对种鸡群具有潜在威胁，需引起注意。

为了更好地了解养殖场中沙门菌的流行情况，建立起常态监测具有重要意义。本试验利用PFGE方法对分离的12株致病性沙门菌分子分型进行溯源分析，结果显示，除菌株36因PFGE带型不明显未进行聚类分析外，其余11株沙门菌分离株包含4种血清型，可分成4种PFGE指纹图谱，各带型间亲缘关系较远，不同血清型的菌株之间的相似度在56%～100%，相同的血清型可能具有聚为 1 簇的趋势，不同血清型菌株之间具有较高的相似度，11株沙门菌具有相同血清型的菌株中具有不同的PFGE图谱，不同血清型的沙门菌菌株可同属一种PFGE指纹图谱，如5株病牛沙门菌可分为2个型别，C9株病牛沙门菌与C10株肠炎沙门菌图谱更为相似。因而说明了PFGE指纹图谱与血清学型别无相关性，相同血清型的沙门菌分离菌株其PFGE图谱不一定相同，PFGE可进一步区分各菌株间的微小差别，因而在沙门菌病流行病学调查及监测中发挥重要作用。沙门菌的PFGE分型结果能够为不同来源的沙门菌数据库的建立提供更详细的资料，本试验为蛋种鸡源沙门菌疾病的进一步净化与防控提供了科学依据。