一种改良的土壤线虫分离方法的效果评估

2022-07-07陈玉秀王娅娟赵成法

大理大学学报 2022年6期

陈玉秀，王娅娟，张发，赵成法*

（1.大理大学东喜玛拉雅研究院，云南大理 671003；2.大理大学农学与生物科学学院，云南大理 671003）

土壤线虫是指生活史的某个阶段或终生生活于土壤中的线虫，是土壤中最为丰富且生态功能最重要的动物之一〔1-2〕。根据其生活方式差异可分为腐生线虫、食微生物线虫和寄生线虫。这类动物具有个体小、种类多、繁殖快、比表面积大和代谢快的特点〔2-3〕，在土壤生态系统物质和能量循环等生态过程中扮演着重要的角色〔1，4-5〕，同时由于对土壤因子的改变极为敏感，其多样性和丰富度不仅是衡量整个土壤生态系统状况的重要指标，也是农田土壤健康与否的主要评判标准之一〔3，6-7〕。土壤植物寄生线虫就危害程度而言仅次于植物病原微生物的病原体，也是众多科研工作者研究的重点对象〔8-10〕。如何准确、快速地将线虫从土壤中分离出来是相关研究不可避免的基础问题，一个可靠、高效的分离方法是相关研究成功与否的关键。

目前常用的土壤线虫分离方法主要有浅盘法、贝尔曼漏斗法和LUDOX TM 悬浮法等〔11-12〕。其中LUDOX TM 悬浮法虽具有较好的分离率，但操作繁琐、成本较高，很难大规模使用。浅盘法操作简便、成本较低，但因其仅利用线虫的亲水性进行分离，导致分离率较低，难以用于精确的定量研究〔13〕。与浅盘法相比，贝尔曼漏斗法不仅利用线虫的亲水性使之从土壤中游离出来，而且在重力作用下下沉到收集管，使分离率有所提高，是目前使用最多的方法〔13〕，但该分离方法依然无法满足定量研究的需要〔14〕。

本研究在改良贝尔曼漏斗法〔15-16〕（简称“改良法1”）的基础上再次进行改良（简称“改良法2”），并对线虫分离率等进行评估，旨在探索更简便、高效和低成本的土壤线虫分离方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料高压蒸气灭菌锅（致微（厦门）仪器有限公司）；恒温培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司）；电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）；体式显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；微量移液器（热电（上海）仪器有限公司）；培养皿（上海五一玻璃仪器厂）；30、35、120、500 目（φ=65 mm）圆形不锈钢滤网（绍兴市上虞区豪泉筛具厂）；三角漏斗（φ＝90 mm）、锥形瓶、烧杯（上海申立玻璃仪器销售有限公司）；琼脂、葡萄糖、液体硅胶（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）。

全齿复活线虫（Panagrellus Redivivus）由大理大学东喜玛拉雅研究院种质资源库提供；土壤采集自大理大学后山茶园，除去大颗粒后，取部分进行间歇式高压蒸气灭菌处理（121 ℃、30 min）后备用。

1.2 方法

1.2.1 线虫及土壤处理方法全齿复活线虫经燕麦培养基于28 ℃培养6 d 后，采用贝尔曼漏斗法分离备用。

人工添加定量线虫土壤样品：土壤经高压灭菌，去除原有线虫。称取土壤样品15 份，每份10 g，体视显微镜下用移液器在每份样品中准确加入150条线虫。

自然农田土壤样品（含不定量线虫）：称取未灭菌土壤样品15 份，每份5 g。

1.2.2 不同分离方法线虫分离率的测定用人工添加定量线虫的土壤样品，按以下不同方法分离土壤线虫，记数并计算分离率，每种方法重复3 次。

线虫分离率= （分离出的线虫数/总线虫数）×100%。

浅盘法：参照毛小芳等〔13〕报道的土壤线虫分离方法，并在其基础上将浅盘改为培养皿，筛网和擦镜纸换为1 层80 目尼龙纱网和2 层擦镜纸。

贝尔曼漏斗法：按文献〔16〕的土壤线虫分离方法进行分离。

LUDOX TM 悬浮法〔14〕：将土壤样品放入烧杯加入100 mL 沸水，冷却后倒入35 目筛网（下接120目、500 目筛网）组合中，用流水缓慢冲洗至水流澄清。依次移除35 目和120 目筛网后，再用流水将500 目筛网内物质缓慢冲洗至流水澄清，最后用密度为1.18 g/mL 的硅胶溶液将500 目筛网内的物质完全冲至500 mL 烧杯中，搅拌均匀后静置1.5 h，将烧杯中的上清液再次倒回500 目筛网，留在筛网上的物质用流水完全冲至样品瓶中即为土壤线虫滤液。重复3 次操作后将线虫滤液混合并计数。

改良法1：参照钟雪超〔16〕报道的土壤线虫分离方法，在该方法的基础上修改而成，漏斗与纱网间增加不锈钢网筛以支撑样品。

改良法2：由改良法1 进一步调整改良。主要区别在于：（1）在乳胶收集管末端注入1~2 mL 含0.04 g/mL 葡萄糖的琼脂以定向吸引线虫；（2）将整个装置置于27 ℃的恒温培养箱中以增强线虫的活力〔17〕。装置见图1。

图1 贝尔曼漏斗改良法2 操作装置

1.2.3 不同分离方法测定自然农田土壤线虫分离的数量按“1.2.2”项下方法分离和测定含不定量线虫的自然农田土壤中线虫的数量，每种方法重复3 次。

1.2.4 不同分离方法分离时长与成本估算记录本研究的3 位参与者独立完成1 份土壤样品处理的实际操作时长即为操作耗时。分离成本为一次性耗材（擦镜纸、葡萄糖、琼脂、液体硅胶等）成本，按照市场价进行估算。

1.3 数据处理所有数据用Excel 软件进行整理，用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分离方法线虫分离率以人工添加定量线虫的土壤样品为实验材料，浅盘法、贝尔曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 悬浮法的分离率分别为（61.77±2.20）%、（72.44±1.37）%、（80.66±1.09）%、（94.89±2.27）%、（91.11±2.20）%。与其他4 种方法相比，改良法2 对线虫的分离率分别提高了33.12%、22.45%、14.23%和3.78%。改良法2与浅盘法、贝尔曼漏斗法和改良法1 相比，线虫分离率差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 不同分离方法线虫分离数量以自然农田土壤样品（含不定量线虫）为实验材料，浅盘法、贝尔曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 悬浮法分离得到的线虫数量分别为（53.00±3.27）、（71.00±2.05）、（83.00±1.63）、（92.00±2.05）、（92.00±3.30）条。与浅盘法、贝尔曼漏斗法和改良法1 等三种方法相比，改良法2 分离出的线虫数量分别增加了39、21、9 条，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 不同分离方法的耗时与成本操作单份样品时，浅盘法、贝尔曼漏斗法、改良法1 和改良法2 均可在5 min 内完成，LUDOX TM 悬浮法则需30~45 min；在分离成本方面，浅盘法、贝尔曼漏斗法、改良法1 和改良法2 分离1 份样品的成本均在1.0 元以内，而LUDOX TM 悬浮法的分离成本为7.5 元。结合线虫分离率，改良法2 在操作耗时与成本方面具备更多优势。见表1。

表1 不同分离方法的操作耗时和成本

3 讨论

实验结果显示，改良法2 和LUDOX TM 悬浮法的线虫分离率无显著差异，但显著高于其他3 种方法（P<0.01）。LUDOX TM 悬浮法是蔗糖悬浮法的改进〔18〕，其分离原理相似，均利用虫体与溶液的密度差进行分离〔15〕，但LUDOX TM 悬浮法很好地克服了高渗溶液易使虫体脱水变形，不利于后续线虫鉴定的缺点〔11，14，19〕。与改良法2 相比，LUDOX TM悬浮法在过筛悬浮前需加入热水，通过高温杀死土壤中的线虫，因此该方法不能区分土壤中的线虫活体与死体，对于需计数活体线虫或需做后续活体线虫实验的研究不适用，加之该方法较为繁琐，操作耗时和成本较高，不宜大规模使用。而改良法2 具有操作简便、操作耗时少、成本低且分离出的线虫大部分为活体的优点，是LUDOX TM 悬浮法较好的替代方法。

贝尔曼漏斗法利用线虫亲水性使之从土壤中游离出来，然后在重力的作用下下沉到收集管中而达到分离线虫的目的。该方法具有操作简便、分离出的线虫悬液杂质少等优点，是众多线虫研究者最常用的方法〔12，14〕。但由于该方法在操作时擦镜纸等过滤层会紧贴于漏斗内壁，增加了漏斗壁上的线虫存留，不利于线虫的下沉。因此对该方法进行了改良，产生了改良法1。该方法以圆形不锈钢筛网支撑样品，一方面减少了漏斗壁上的线虫存留，另一方面增加了样品与水的接触面积，从而提高了线虫分离率〔15-16〕。在此基础上，基于24~30 ℃是线虫活力最强的温度的理论〔17〕和线虫的趋化特性，改良法2 在收集管的末端加入了葡萄糖琼脂定向吸引线虫，同时将整个分离装置置于27 ℃环境下增加线虫的活力，使之更快地从土壤中游离出来。实验结果显示，改良法2 虽然略微增加了操作耗时和成本，但对线虫的分离率明显高于改良法1，是改良法1 良好的替代方法。

基于改良法2 的分离原理，由于不同类型的线虫对物质的趋化性不同，当需要分离某一特定类群时需对添加的趋化物做一定的调整。如CuSO4对甜菜孢囊线虫的二龄幼虫有极强的吸引作用〔20〕；秀丽隐杆线虫对氯化钠或异戊醇均有趋向性，且化学趋向性随着温度的增加而增强〔21〕。因此，在实际操作中可根据需求，选择相应的趋化物来提高对特定线虫的分离率。