荔枝园间作平托花生对土壤理化性质、酶活性和 细菌群落结构及多样性的影响

颜彩缤，胡福初，赵 亚，王祥和，陈 哲，张世青，吴凤芝，范鸿雁*

（1．海南省农业科学院三亚研究院，海南 三亚 572000；2．海南省农业科学院热带果树研究所， 农业农村部海口热带果树科学观测实验站，海南省热带果树生物学重点实验室， 海南省热带果树育种工程技术研究中心，海南 海口 571100）

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）属无患子科、荔枝属，原产于中国，其栽培历史悠久，是一种营养丰富、对人类健康有益的南亚热带水果[1-2］。‘妃子笑’荔枝是海南种植范围较广的早熟荔枝品种[3］，但该品种成花时花量大，消耗土壤养分过多，保果难度大，土壤缺钙缺水时严重影响花叶正常生长[4］。平托花生（Arachis pintoi cv. Amarillo）又称野花生，是一种热带亚热带豆科牧草，为多年生匍匐性蔓生草本植物。本试验采用的‘热研12号’平托花生是1991年中国热带农业科学院热带牧草研究中心从哥伦比亚国际热带农业研究中心（CIAT）引进筛选的具有耐酸、耐瘠、耐旱、耐荫、适应性强、覆盖性强、无需人工除草、减少除草剂使用量等特点的品种[5］。有研究表明，荔枝园间作平托花生不仅具有增加土壤肥力、提高保水性能、改善园内小气候和控制杂草生长等作用，还能提高果品质量，是生态果园优良的套间种植物[6］。

果园间作在生产中应用广泛，易显凤等[7］在杧果、龙眼和荔枝园种植豆科牧草试验中发现，种植豆科牧草不仅能抑制果园杂草生长，还能提高土壤肥力以及促进果树健康生长；颜彩缤等[8］研究得出槟榔园间作平托花生能提高不同土层中的土壤有机碳、全氮和全磷等理化因子以及土壤蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和蛋白酶的含量；刘芳等[9］得出剑麻园内种植平托花生不仅能提高土壤保水性能，还能提高土壤养分，且套种时间越长，效果越显著；覃婵婵[10］研究发现，荔枝幼龄果园间作大豆和红薯可以显著改善土壤的物理性状，提高养分利用效率以及显著增加荔枝园土壤微生物多样性。目前，关于荔枝园间作平托花生对土壤理化性质、酶活性以及土壤细菌群落结构及多样性的影响还未见报道，其土壤理化性质与细菌的相关性尚未明确，本试验以荔枝间作平托花生和荔枝单作地区10～20 cm土层的土壤为研究对象，采用Illumina Miseq高通量测序技术对土壤细菌群落V4～V5区片段进行测序和生物信息学分析，揭示荔枝间作平托花生和荔枝单作土壤理化性质、酶活性和土壤细菌群落结构及其多样性的变化，并分析土壤理化性质与土壤细菌的相关性，为筛选荔枝果园良好复合栽培模式提供科学的理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试荔枝品种为‘妃子笑’，于1998年定植，种植规格为4 m×5 m；间作物平托花生品种为‘热研12号’，于2015年定植于荔枝树茎基部 1.5 m处。

1.2 试验地概况

试验区位于海南省澄迈县永发果树基地荔枝示范果园（109°45′～110°15′ E、19°23′～20°01′ N）。热带季风气候，四季如春，雨量充沛，日照充足，年平均气温为23.7℃，极端高温为38℃，极端低温为7℃。6月最热，平均气温达35℃，2月最冷，平均气温达15℃。试验地土壤为红壤土，全年日照时数为2060.6 h，年均降水量为1756 mm，全年无霜。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计

试验设计2个处理，荔枝间作平托花生和荔枝单作，每个处理3个重复，分别编号为LP-1、LP-2、LP-3和CK-1、CK-2、CK-3。

1.3.2 土壤样品采集

在平托花生营养生长期采集土壤样品，每个重复采取5点取样法选择5株荔枝。2019年12月分别在荔枝间作平托花生和荔枝单作试验处理区，于荔枝根系和平托花生交界处（大约距离荔枝树茎基部1.5 m处）东、西、南、北4个方向，拔开平托花生茎蔓后挖取10～20 cm土层根际土壤，混匀后分别装入无菌瓶与密封袋中。无菌瓶放入装有冰袋的保温箱，密封袋常温放置，带回实验室进行处理。在超净工作台上将无菌瓶内土壤样品的杂根去除，分装于50 mL灭菌离心管中，-20℃下保存，用于高通量测序；密封袋土样过1 mm筛，常温下保存，用于土壤理化因子和土壤酶活性分析。

1.3.3 土壤理化因子测定

采用水合热重铬酸钾氧化法测定土壤有机碳；采用半微量凯氏定氮法测定全氮；采用碱解扩散法测定碱解氮；采用王水酸溶钼锑抗比色法测定全磷；采用双酸浸提钼锑抗比色法测定酸性有效磷；采用碱熔-火焰光度法测定全钾；采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定速效钾；采用铝盒烘干法测定干湿比；采用酸度计测定土壤pH。测定方法参考鲁如坤[11］的方法。

1.3.4 土壤酶活性测定

采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶；采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定脲酶；采用分光光度法测定过氧化氢酶；采用邻苯三酚比色法测定多酚氧化酶；采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑比色法测定脱氢酶；采用酪蛋白水解法测定蛋白酶。测定方法参考关松荫等[12］和周礼恺[13］的方法。

1.3.5 土壤总DNA的提取

使用FastDNA® SPIN Kit for Soil试剂盒提取样本土壤微生物基因组的DNA，干冰运输，由上海天昊生物科技有限公司采用Illumina Miseq测序平台对土壤细菌进行16S扩增子绝对定量测序（V4～V5）。

1.4 数据处理

对原始数据进行质量控制，获得更为精准、高质量、可用于分析的序列；应用Usearch、QIIME，根据序列97%的相似度，将序列归并后划分为多个OTUs。利用Mothur、R计算Chao1和ACE丰富度指数以及Simpson和Shannon多样性指数，并进行Alpha多样性分析；同时进行细菌群落分布、聚类分析和细菌功能预测分析。采用SPSS 20.0独立t检验分析土壤理化因子和土壤酶活性差异性，利用Canoco 5构建细菌菌属与土壤理化因子的相关性。

2 结果与分析

2.1 间作对土壤理化性质的影响

由表1可知，荔枝园间作平托花生后，土壤的特定理化因子具有显著性差异。间作平托花生后速效钾含量极显著增加138.9%；碱解氮含量显著减少19.6%；全氮、全钾和干湿比均提高，全磷、酸性有效磷以及pH稍降低，但均无显著性差异。

表1 土壤理化性质

2.2 间作对土壤酶活性的影响

由表2可知，间作模式较单作模式的土壤酶活性均有所提高，其中蔗糖酶和酸性蛋白酶分 别极显著增加154.4%和76.5%；脲酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶分别显著增加15.0%、16.9%和32.6%；中性、碱性蛋白酶稍有增加但均无显著差 异性。

表2 土壤酶活性

2.3 间作对土壤细菌群落的影响

2.3.1 间作后土壤细菌群落多样性分析

为明确荔枝园间作平托花生能否提高土壤细菌丰富度和多样性，对两种种植模式的土壤细菌群落进行Alpha多样性分析，其中荔枝间作模式较单作模式的Chao1指数、ACE指数分别显著提高5.5%、5.2%，间作后细菌丰富度明显提高；Simpson指数显著提高3.7%；而间作的物种数目和Shannon指数与单作相比无明显差异（表3）。

表3 不同样品的α多样性指数

2.3.2 间作后土壤细菌群落组成分析

2.3.2.1 土壤细菌群落结构在门水平的分析 从图1可知，荔枝在两种种植模式下土壤细菌群落平均相对丰度＞1%的门类群共有12个，其中优势菌门为酸杆菌门（Acidobacteria 28.38%～ 22.78%）、变形菌门（Proteobacteria 20.63%～ 27.26%）、绿弯菌门（Chloroflexi 8.81%～12.23%）和放线菌门（Actinobacteria 8.33%～11.21%）。箱体图（图2）显示间作模式和单作模式下具有显著差异性的菌门，间作平托花生后变形菌门和放线菌门的相对丰度分别极其显著和显著提高，酸杆菌门相对丰度极显著降低。

图1 土壤门水平上的细菌群落组成

图2 土壤细菌门水平箱形图

2.3.2.2 土壤细菌群落结构在属水平的分析 由图3显示的供试细菌菌群平均相对丰度＞1%的属类群共有16个，其中单作模式12个，间作模式为14个；两种模式相同优势菌属为Gp1（8.5%～4.72%）、Gp2（5.03%～1.95%）、Gp3（1.64%～1.36%）、Gp4（1.44%～2.33%）、Gp6（3.98%～5.82%）、芽孢杆菌属（Bacillus 2.16%～1.58%）、Gaiella（2.12%～3.17%）、芽单胞菌属（Gemmatimonas 1.87%～2.2%）、亚硝化球菌属（Nitrososphaera 1.3%～2.78%）和硝化螺菌属（Nitrospira 1.22%～1.22%），而Gp7仅存在于单作模式，红游动菌属（Rhodoplanes）、黄杆菌属（Flavobacterium）和Gp5仅存在于间作模式；此外，间作模式下Gp6菌属相对丰度最高，但单作模式下Gp1菌属相对丰度最高。对测定菌属进行显著差异分析，由箱体图（图4）可知，间作后红游动菌属、Gaiella和黄杆菌属的相对丰度极显著或显著提高，但芽孢杆菌属、Gp2和Candidatus_Koribacter相对丰度显著降低。

图3 土壤属水平上的细菌群落组成

图4 土壤细菌属水平箱形图

2.4 土壤细菌与理化因子的相关性分析

在属分类水平上，对土壤总细菌中相对丰度大于1%的细菌进行冗余分析，以探究特定细菌与土壤理化因子的关系。排序轴1对土壤总细菌变异程度的解释度为71.64%，排序轴2解释了15.15%的变异，对细菌群落结构的解释度总共高达86.79%（表4）。由条件效应可知，碱解氮解释的变异程度最高，为55.7%，pH、全磷和酸性有效磷解释度分别为18.0%、13.7%和10.3%（表5）。由图5可见，Gp1、Gp2、Gp3及Gp7与pH呈正相关；Gp4、Gp5、Gp6与pH呈负相关；芽孢杆菌属与碱解氮呈正相关；Gaiella、红游动菌属和黄杆菌属均与碱解氮、pH、全磷及酸性有效磷呈负相关；芽单胞菌属与有效磷、全磷呈负相关；亚硝化球菌属与碱解氮、pH呈负相关；硝化螺菌属与pH呈负相关，但与酸性有效磷、全磷呈正相关。单作模式（CK）的土壤样品主要分布在第3象限，其细菌群落结构差异主要是由pH的变化引起；间作模式（LP）的土壤样品分布第1和第4象限，其细菌群落结构主要受碱解氮的影响。

图5 属水平土壤主要细菌类群与土壤理化因子的关系

表4 土壤因子与土壤细菌属水平RDA分析结果

表5 主要土壤因子RDA结果

3 讨论

3.1 间作对土壤理化性质的影响

土壤钾素对增加产量、提高果实品质和保持土壤肥力起到重要作用[14］，间作平托花生后速效钾含量极显著增加，这是由于受到平托花生根系的影响，非根区土壤速效钾向根区转移，而且距离根区越近，钾素移动量越大[15］。作物生长期间，氮素施用容易导致豆科植物产生“氮阻遏”现象，也就是结瘤数量和生物固氮量下降[16］，荔枝与平托花生间作后碱解氮含量显著减少，原因可能是荔枝树能大量吸收土壤硝酸盐，并减少矿质氮含量，对豆 科作物“氮阻遏”起减缓作用，间作群体通过直接或者间接的“氮转移”促进土壤氮素的高效利用[17］，因此，间作平托花生后碱解氮含量显著减少与间作平托花生具有的固氮作用密切相关。

3.2 间作对土壤酶活性的影响

土壤酶是土壤中产生的能够参与转化土壤有机化合物和分解动植物残体过程的生物催化剂，可作为土壤肥力的重要指标之一[18］。其中，蔗糖酶参与土壤有机质降解，酸性蛋白酶加速土壤的氮素循环，脲酶参与氮元素转化过程，过氧化氢酶可分解有害物质，还有多酚氧化酶参与土壤芳香族化合物循环[19-21］。本试验中荔枝园间作平托花生后土壤蔗糖酶、酸性蛋白酶、脲酶、过氧化氢酶及多酚氧化酶活性均显著提高，尤其是蔗糖酶和酸性蛋白酶 的活性提高幅度较大，可能是由于平托花生根系的穿插作用影响土壤的孔隙度和通气状况，其根系分泌物质改变土壤微生物环境从而提高土壤酶活性[8］。

3.3 间作对土壤细菌群落多样性的影响

果园生草栽培可以有效控制杂草的生长从而减少或避免使用化学除草剂，同时草的凋落物以及根系分泌物为果园土壤微生物提供了丰富的营养物质，最终对土壤微生物优势种群和数量的变化产生影响[22-23］。Chao1指数和ACE指数反映土壤细菌群落丰富度，Shannon指数和Simpson指数体现群落均匀度，与群落多样性呈正相关[24］。本试验中Chao1指数、ACE指数以及Simpson指数均显著提高，说明荔枝园间作平托花生有效提高了土壤细菌群落丰富度、多样性和优势OTUs，在改善土壤生态环境和提高土壤微生物多样性方面起着重要作用。

3.4 间作对土壤细菌群落组成的影响

各菌群相对丰度的不同反映了土壤环境的变化，变形菌门多存在于营养较高的土壤环境，属于富营养细菌，酸杆菌门多存在于营养贫瘠的土壤环境，属于寡营养细菌[25］，放线菌作为植物根际土壤的一种重要微生物，有着促进植物生长发育、防治病害的作用[26-27］。本研究中荔枝间作模式下变形菌门、放线菌门的相对丰度均显著提高，酸杆菌门相对丰度显著降低。酸杆菌是广泛分布在土壤中的嗜酸菌，其相对丰度体现土壤酸性条件[28］，有研究表明酸杆菌与土壤pH呈显著负相关[29-30］，也有研究表明土壤酸杆菌的相对丰度与土壤pH呈显著正相关关系[31-32］。间作平托花生后酸杆菌门相对丰度显著降低，但土壤pH无显著差异性，这与Liu等[33］的研究结果一致。导致这些差异情况产生的原因可能是不同亚群或同一亚群中的酸杆菌对土壤pH具有不同的响应作用[34］。

3.5 土壤细菌与理化因子的相关性分析

冗余分析表明，酸杆菌门亚群Gp1～Gp7与pH均存在相关性，Gp1、Gp2、Gp3及Gp7与pH呈正相关，Gp4、Gp5、Gp6与pH呈负相关，说明酸杆菌门不同亚群对土壤pH均有不同的调节作用；与土壤pH相关的菌属还有Gaiella、红游动菌属、黄杆菌属、亚硝化球菌属和硝化螺菌属。间作平托花生后细菌群落结构差异从主要受土壤pH影响转变成主要受碱解氮含量影响，这与林洪鑫等[35］发现pH是影响土壤细菌群落结构差异的主要理化因子，但施用氮肥和间作花生均能显著影响土壤细菌属水平群落组成的研究结果基本一致。本研究中绝大多数的菌属与土壤理化因子均呈负相关，推测是由于土壤细菌能够分解和利用土壤养分从而为自身或植物提供能量[36］。

4 结论

荔枝园间作平托花生提高了土壤供钾能力，但降低了供氮能力，pH稳定，说明长期间作平托花生可适当施用氮肥。间作平托花生后土壤蔗糖酶、酸性蛋白酶和脲酶等酶活性的提高能够改善土壤肥力，影响土壤营养元素循环和转化过程；同时土壤细菌丰富度、多样性的有效提高以及土壤细菌群落结构的优化，为荔枝栽培提供良好的环境条件，有效促进植株的健康生长。