五产区间黑果枸杞甜菜碱的含量测定及比较研究

潘 菲，韩晓萍

(1. 青海大学医学院，青海西宁 810016；2. 青海省药品检验检测院， 青海省中藏药现代化研究重点实验室，青海 西宁 810016；3. 国家药品监督管理局(藏药)质量控制重点实验室，青海西宁 810016)

黑果枸杞为(LyciumruthenicumMurr. )为茄科(So- lanceae)枸杞属(LyciumL. )植物[1]的干燥成熟果实，主要分布于我国新疆、甘肃、内蒙古、青海、宁夏、山西、陕西、西藏境内[2]，有着独特的抗旱抗盐碱特性，可用于防治土壤沙漠化、缓解土壤盐碱化[3]，属于典型的荒漠植物. 黑果枸杞不仅是营养丰富的传统食品，以其为原料生产的深加工滋补产品种类繁多[4-5]；而且在藏药、维吾尔医药中应用历史久远，有治疗月经不调、心脏病等的功效，和补脑、健身、强肾、滋肝、明目的作用[6-9].

甜菜碱(Betaine)是一种季铵型生物碱，广泛存在于各种动植物体内，是自然界中的一种天然营养物质.植物的主要非生物胁迫其中之一为土壤盐分，限制了其正常生长和发育[10-11]，黑果枸杞作为一种宝贵的盐生植物，常生于盐碱土荒地、盐湖岸边或盐化沙地等盐渍化土壤中，其中的主要化学成分甜菜碱起到了重要作用[12].甜菜碱还具有促进生物发酵、调节渗透压、抗应激等功效[13-14]，并且在动物养殖业中作为新型饲料而广泛应用[15].

本文采用高效液相色谱法(HPLC)对黑果枸杞中甜菜碱含量进行测定，并比较青海、甘肃、新疆、宁夏、内蒙不同产区的黑果枸杞甜菜碱的含量，以期对青海产黑果枸杞质量控制和品质评价提供一定的科学依据.

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695 型高效液相色谱仪，美国WATERS公司；BSA224S 电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；HH-4 型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；TB-Z 型真空恒温干燥箱，天津药典标准仪器厂；GenPurexCAD 型纯水机.

1.2 试药

1.2.1 对照品

甜菜碱(批号110894-200503)，纯度99.2%，约50 mg/瓶，购自于中国食品药品检定研究院.

1.2.2 试剂

乙醇，AR，昆山金城试剂有限公司；甲醇，AR，四川西陇科学有限公司；中性氧化铝，FCP，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，GR，西陇化工股份有限公司；五氧化二磷，AR，佛山西陇化工有限公司；水为超纯水.

1.2.3 药材

黑果枸杞为茄科枸杞属植物黑果枸杞的干燥成熟果实，白刺果为蒺藜科白刺属植物白刺的干燥成熟果实(共采集47 批次黑果枸杞，其中青海20 批次，甘肃7 批次，新疆8 批次，内蒙古6 批次，宁夏6 批次；白刺果3 批次，采自青海)，样品的详细信息来源见表1.

表1 样品信息来源汇总Table 1 Summary of sample information

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为 Luna HILIC 柱(100 ×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(85∶15)；体积流量 1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长195 nm；进样量5 μL.在该色谱条件下，理论塔板数不低于3 000.本方法测定的系统适用性测定图谱见下图1.

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液

精密称取甜菜碱对照品适量，用蒸馏水溶解，即得浓度约为2.0 mg/mL 的甜菜碱对照品溶液.

2.2.2 供试品溶液

取具有代表性试样50 g，粉碎至均匀，装于袋中干燥保存，防止吸潮. 精密称取样品粉末1 g(精确到0.000 1 g)，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过.精密量取续滤液2 mL，置碱性氧化铝固相萃取柱(2 g)上，用乙醇30 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水溶解，转移至2 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

2.3 黑果枸杞甜菜碱含量测定

2.3.1 标准曲线的制备

精密吸取甜菜碱对照品储备液0.3、0.6、1.2、1.5、1.8 mL 置10 mL 棕色容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度.以甜菜碱对照品浓度为横坐标，以响应峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，通过线性回归得到方程:Y=833 068X ＋5 040.5 (r=0.999 4)，结果表明甜菜碱在0.06 ～0.36 mg/mL 范围内线性关系良好.

2.3.2 精密度实验

精密称取同一批样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件连续进样6 次，记录响应峰面积.结果表明，各响应峰面积RSD=1.83%，表明所用方法精密度良好.

2.3.3 重现性实验

精密称取同一批样品平行6 份，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件进样，记录响应峰面积.结果表明，各响应峰面积RSD=2.73 %.

2.3.4 稳定性实验

取同一份供试品溶液，置于阴暗处，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1”项下色谱条件进样测定，记录响应峰面积.结果表明，各响应峰面积RSD=2.08%，表明供试品溶液在制备后24 h 内稳定性良好.

2.3.5 加样回收实验

采用加标回收率实验，精密称取同一批样品，分别精密加入80%、100%、120%的甜菜碱标准品溶液，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件进样，记录响应峰面积，依法测定黑果枸杞甜菜碱含量，计算回收率. 平均回收率为93.04%，RSD=2.49%，结果见表2.

表2 加样回收实验结果Table 2 Experimental results of sample recovery

2.3.6 甜菜碱含量测定

取50 批次的样品平行3 份，分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录响应峰面积，利用标准曲线，计算黑果枸杞甜菜碱含量.结果见表3.

数据处理采用SPSS 20.0 对样品的甜菜碱含量测定结果进行统计分析和图表绘制(表3，图1).

表3 50 批次样品甜菜碱含量测定结果Table 3 Determination of betaine in 50 batches of samples

图1 对照品HPLC 色谱图(a)和样品的HPLC 色谱图(b)Fig.1 HPLC of reference substance and sample

3 结果

3.1 黑果枸杞甜菜碱含量

黑果枸杞样品中甜菜碱平均含量为(0.66 ±0.20) g/100 g，含量范围是0.23 ～1.31 g/100 g，且按照α=0.05，经过正态检验，这47 批次黑果枸杞的甜菜碱含量符合正态分布，见下图2.

图2 黑果枸杞甜菜碱含量测定结果分布Fig.2 Distribution of betaine content in Lyciumbarbarum L.

五大产区中，青海产区黑果枸杞甜菜碱平均含量为(0.73 ±0.23) g/100 g，含量范围是 0.47 ～1.31 g/100 g；甘肃产区黑果枸杞甜菜碱平均含量为(0.53 ±0.22) g/100 g，含量范围是0.23 ～0.87 g/100 g；新疆产区黑果枸杞甜菜碱平均含量为(0.64 ±0.11) g/100 g，含量范围是 0.48 ～0.86 g/100 g；内蒙古产区黑果枸杞甜菜碱平均含量为0.60 g/100 ±0.16 g，含量范围是0.55 ～0.85 g/100 g；宁夏产区黑果枸杞甜菜碱平均含量为(0.69 ±0.11) g/100 g，含量范围是0.23 ～1.31 g/100 g.结果见下表4.

表4 黑果枸杞甜菜碱含量Table 4 Content of betaine inLyciumbarbarum L.

3.2 不同产地黑果枸杞甜菜碱含量比较

研究表明，不同的环境(温度、湿度、日照等)导致黑果枸杞有效成分积累不同，不同的产区黑果枸杞甜菜碱含量也不同. 按照α =0.05，经过均值差异性检验(F 检验、t 检验、秩和检验)，表明在统计学意义上，五大产区之间黑果枸杞甜菜碱含量无差异，结果见下图3. 五大产区中，青海产区黑果枸杞甜菜碱含量最高，为0.73 g/100 g；宁夏、新疆产区黑果枸杞甜菜碱含量次之，分别为 0.69 g/100 g，0.64 g/100 g；内蒙古、甘肃产区黑果枸杞甜菜碱含量最低，分别为0.60 g/100 g，0.53 g/100 g.

图3 不同产区黑果枸杞甜菜碱含量比较(P ＜0.05)Fig.3 Comparison of betaine content of Lyciumbarbarum in different producing areas(P ＜0.05)

3.3 黑果枸杞与混伪品白刺果的甜菜碱含量比较

研究表明，甜菜碱为黑果枸杞的主要成分. 按照α=0.05，经过均值差异性检验(F 检验、t 检验、秩和检验)，表明在统计学意义上，黑果枸杞与混伪品白刺果甜菜碱含量有显著差异，结果见下图4. 其中黑果枸杞甜菜碱含量较高，为0.66 g/100 g；白刺果甜菜碱含量较低，为0.14 g/100 g.

图4 黑果枸杞与白刺果甜菜碱含量比较注:不同小写字母表示不同药材间差异显著(P ＜0.05)Fig.4 Comparison of betaine content between Lyciumbarbarum and Nitrariaprzewalskiinote:different lowercase letters indicate significant differences among different medicinal materials (P ＜0.05)

我们还对黑果枸杞近科属变异植物白枸杞的甜菜碱含量进行了测定，为 0.52 g/100 g；按照 α =0.05，经过均值差异性检验(F 检验、t 检验、秩和检验)，表明在统计学意义上，白果枸杞与混伪品白刺果甜菜碱含量有显著差异，白枸杞与黑果枸杞甜菜碱含量没有差异，且黑果枸杞中甜菜碱含量最高.

4 讨论

甜菜碱成分含量测定大部分采用离子色谱法、紫外分光光度法、酸碱滴定法等等[16]，常用色谱柱为氨基色谱柱、离子交换色谱柱和反向色谱柱. 本实验采用HPLC 进行甜菜碱的含量测定，简便、准确、成本低；且色谱柱采用亲水相互作用色谱柱(Hilic 柱)，选择乙腈-水(85∶15)作为流动相，等度洗脱，结果分离良好，保留时间在2.5 min 左右，与文献报道的一致[12]，因此该方法适合测定黑果枸杞中甜菜碱的含量.

耿丹丹等[17]利用离子色谱法测定，黑果枸杞中的甜菜碱含量范围为9.44 ～19.58 mg/g，且黑果枸杞中甜菜碱含量最高的产地在甘肃民勤县；娄涛涛等[18]和艾则孜江等[19]利用氨基柱作为色谱柱测定出黑果枸杞甜菜碱含量范围为0.825 ～1.279 mg/g 和0.619 ～1.185 mg/g，甜菜碱含量最高的产地分别为青海省和新疆蜻河县.本实验测得黑果枸杞甜菜碱含量范围为2.3 ～13.1 mg/g，略高于娄涛涛等人测定的含量，说明亲水相互作用色谱柱保留效果略优于氨基色谱柱，但略低于耿丹丹等人测定的含量，说明离子色谱保留效果略优于液相色谱. 本实验成功建立HPLC 法测定黑果枸杞甜菜碱含量，且利用该法在五大产区中进行黑果枸杞甜菜碱测定.

不同的环境(温度、湿度、日照等)导致黑果枸杞有效成分积累不同，不同的产区黑果枸杞甜菜碱含量也不同.本实验测得黑果枸杞甜菜碱含量由高到低依次为:青海＞宁夏＞新疆＞内蒙＞甘肃；其中青海产区黑果枸杞甜菜碱含量较其他四大产区略高，可能是由于青海省产区平均海拔高、日照时间长、昼夜温差大等得天独厚的地理环境，适宜黑果枸杞甜菜碱成分的积累；其中青海海西格尔木市的黑果枸杞甜菜碱含量最高，为1.31 g/100 g，略高于娄涛涛等[18]和李钦俊等人[20]测定的黑果枸杞甜菜碱的最高含量，为1.28 g/100 g 和1.11 g/100 g，且甜菜碱含量最高的黑果枸杞产地都在青海省.

黑果枸杞与黑果枸杞混伪品白刺果以及近科属变异植物白枸杞甜菜碱含量比较中，确定甜菜碱为黑果枸杞植物的特征成分，含量高于二者；并且与娄涛涛等人[21]运用指纹图谱技术相比，甜菜碱可以作为特征指标，将黑果枸杞与混伪品白刺果进行有效区分，方法更简便、高效.

5 结论

本实验采用HPLC 法测定黑果枸杞中甜菜碱含量，并将青海、甘肃、新疆、内蒙以及宁夏五大产区的黑果枸杞中甜菜碱含量进行比较，通过甜菜碱成分的积累来初步推断药材品质，有助于黑果枸杞药材标准的制定；并且实验测得五大产区中青海省黑果枸杞中甜菜碱含量较高，更为青海省特色药材资源的开发与利用奠定了基础.