石榴花多酚改善糖尿病大鼠肾损伤的机制研究

陈 炯，郦特军，邓 卉，陈晓燕，邱振军

(1.绍兴第二医院 内分泌科，浙江 绍兴 312000；2.重庆市中医院 妇科，重庆 400011；3.中国科学院新疆理化技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830011)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的微血管并发症，其发病原因为长期的高血糖导致肾脏血管损伤，继而引发肾功能障碍。石榴提取物含有丰富多样的多酚类物质，石榴多酚可以预防和治疗癌症、心血管和炎症疾病。此外，研究表明石榴花多酚可降低链脲佐菌素(streptozocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠胰岛素抵抗，改善大鼠血脂、肝糖原含量及抗氧化状态，抑制内质网应激。酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase，ASMase)是神经酰胺产生的一种必需酶，参与了多发性硬化症、糖尿病、肾脏病和脂质代谢紊乱等各种疾病的发生发展。下调ASMase可减轻糖尿病大鼠血管内皮胰岛素抵抗，因此，抑制ASMase活性可能是治疗和预防糖尿病及相关肾损伤的一种新的治疗策略。本研究旨在探究石榴花多酚通过抑制ASMase和内质网应激对大鼠糖尿病肾损伤的作用，以期明确石榴花多酚在糖尿病中的作用，为糖尿病的治疗提供新的科学资料。

1 材料和方法

1.1 实验动物 40只6周龄雄性SD大鼠，购自重庆医科大学实验动物中心(生产许可证号：SCXK(渝)2018-0003)，饲养于标准动物房。实验动物的饲养及使用均通过重庆医科大学实验伦理委员会批准。

1.2 试剂 石榴花多酚由中科院新疆理化所提供；地昔帕明和链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司；大鼠尿素氮(BUN)和血肌酐(S-Cr)检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；尿蛋白检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Masson试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购自德国Roche；ASM抗体和CHOP抗体购自美国Cell Signaling Technology；GRP78抗体购自英国Abcam公司；GAPDH和HRP标记二抗购自武汉Proteintech公司；SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒购自日本TAKARA公司。

1.3 模型建立及分组 40只6周龄SD雄性大鼠随机分为对照组、模型组、石榴花多酚组和地昔帕明组，每组各10只。对照组大鼠用普通饲料喂养4周。其余组大鼠用高脂饲料喂养4周后，腹腔注射STZ(30 mg/kg)，对照组大鼠注射等量溶剂，72 h后空腹血糖水平≥16.7 mmol/L即表示造模成功。模型组、石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠仍用高脂饲料喂养。石榴花多酚组大鼠灌胃石榴花多酚(300 mg/kg/d)，地昔帕明组大鼠灌胃地昔帕明(10 mg/kg/d)(ASMase抑制剂)，对照组和模型组灌胃生理盐水，持续8周。

1.4 血糖、血清尿素氮和血肌酐检测 给药结束后，各组大鼠尾静脉抽取血液标本，血糖测试仪检测空腹血糖水平。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，眼球采血，收集血液，1 000 g离心10 min收集血清，根据大鼠尿素氮(BUN)ELISA试剂盒和大鼠血肌酐(S-Cr)ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠血清BUN和S-Cr水平。

1.5 24 h尿蛋白含量测定 各组大鼠末次灌胃结束后，收集24 h尿液，根据尿蛋白检测试剂盒说明书检测各组大鼠24 h尿蛋白含量。

1.6 细胞学观察 1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后取肾组织，4%多聚甲醛固定过夜。组织梯度酒精脱水透明，组织浸蜡、包埋、切片。采用PAS染色、Masson染色观察大鼠肾组织细胞病理学变化，并于镜下用微测量尺测定垂直径，肾小球的体积是肾小球面积的三分之二次方的 1.25 倍。TUNEL染色观察细胞凋亡情况，凋亡的细胞在经染色后其细胞核被染为棕褐色，正常细胞的细胞核被染为蓝色，凋亡细胞数/总细胞数×100%，即为细胞凋亡率。

1.7 内质网应激标志物观察 免疫组化观察内质网应激标志物GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达情况，RT-PCR检测 CHOP和GRP78 mRNA表达水平。以GAPDH为内参，2法计算CHOP和GRP78 mRNA表达。

1.8 Western blot检测ASMase蛋白表达 1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉大鼠，取肾脏。把肾脏组织剪切成细小的碎片，RIPA裂解液裂解组织，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。取20 μg蛋白进行SDS-PAGE分离，随后转至PVDF膜上。10%脱脂奶粉封闭，随后加入ASMase(1∶2 000)抗体和GAPDH(1∶5 000)抗体，4 ℃条件下过夜孵育。加入HRP标记二抗(1∶5 000稀释)室温孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化学发光成像仪检测。Image J 软件进行条带灰度扫描，以 β-actin 作为内参，分析结果。

1.9 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件，至少取3次独立实验结果，两组间比较采用检验，多组间比较采用单向方差分析，<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验室检测指标 各组大鼠血糖、BUN、Scr和24 h尿蛋白水平检测结果见表1。与对照组相比，模型组大鼠血糖水平、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量显著升高；与模型组相比，石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠血糖水平、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量显著降低；差异均有统计学意义(<0.05)。

表1 各组大鼠血糖水平、BUN、Scr和24 h尿蛋白含量

2.2 DN大鼠肾组织病理变化 与对照组相比，模型组大鼠肾小球体积增大并出现大量蓝染胶原纤维，系膜基质扩张，系膜细胞增生，基底膜轻度增厚，见封三图1、图2。石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠的肾小球体积均小于模型组，差异有统计学意义(<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠肾小球体积

2.3 DN大鼠肾细胞凋亡情况 模型组大鼠肾细胞凋亡率高于对照组，石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠肾细胞凋亡率低于模型组，差异均有统计学意义(<0.05)。见表3。各组大鼠肾细胞凋亡情况见图1。

表3 各组大鼠肾细胞凋亡率

图1 TUNEL染色检测各组大鼠肾细胞凋亡(×400)

2.4 内质网应激标志物表达情况 各组大鼠肾脏内质网应激标志物GRP78蛋白和CHOP蛋白的表达情况见封三图3、图4。石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠肾脏GRP78和CHOP 的mRNA和蛋白表达均低于模型组，差异均有统计学意义(<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠肾脏内质网应激标志物GRP78和CHOP的表达

2.5 DN大鼠酸性神经鞘磷脂酶的表达 Western blot检测结果显示，对照组、模型组、石榴花多酚组和地昔帕明组大鼠的肾脏ASMase蛋白表达水平分别为(1.00±0.07)、(4.20±0.42)、(2.35±0.37)、(2.53±0.30)，4组间差异有统计学意义(=51.288，<0.001)，模型组最高。见图2。

图2 Western blot检测各组大鼠肾脏ASMase表达

3 讨论

糖尿病肾病(DN)是终末期肾功能衰竭的主要原因，是全球糖尿病患者发病率和死亡率的主要因素，表现为肾小球肥大、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蛋白沉积、系膜基质和肾小球基底膜扩张、肾小管间质纤维化、蛋白尿失量过大和废物清除功能随时间推移而丧失。事实上，大多数糖尿病患者的心血管疾病死亡率与糖尿病肾病有关。

石榴花是我国的一种传统中药，具有很强的抗氧化能力。石榴在某些传统医学体系中被认为是一种降糖药，石榴花提取物可以有效地降低血糖和保护肝脏。然而，石榴花提取物在糖尿病中的作用还有待继续探讨。石榴多酚在预防代谢相关疾病如肥胖、糖尿病和相关并发症方面具有有益作用。研究表明，石榴皮提取物能有效改善STZ诱发的C57BL/6小鼠1型糖尿病的临床症状。石榴汁可减少氧化应激和钾的消耗，减轻卡托普利和庆大霉素诱导的肾毒性作用，对肾脏具有保护作用。

内质网应激是细胞在应激环境下的一种适应性反应，是肾脏疾病的标志。已有研究证明，石榴花多酚对STZ诱导的糖尿病大鼠胰岛素抵抗具有改善作用，改善大鼠血脂、肝糖原含量及抗氧化状态，抑制内质网应激。本研究结果显示，石榴花多酚可降低糖尿病大鼠血糖，改善肾脏病理组织学变化，抑制肾细胞凋亡和内质网应激。

研究表明，ASMase途径可促进肾小球硬化疾病进程。此外，高血糖通过增强ASMase活性，提高糖尿病大鼠神经酰胺水平，最终导致大鼠肾脏损伤。另有研究表明，糖尿病视网膜病变动物模型的视网膜血管中ASMase被激活，并且ASMase的抑制可以作为治疗糖尿病视网膜病变的潜在治疗策略。抑制ASMase表达，可以改善糖尿病小鼠血管功能障碍。本研究以地昔帕明(ASMase抑制剂)为阳性对照，观察石榴花多酚对ASMase的影响，结果表明，糖尿病大鼠肾脏中ASMase表达升高，石榴花多酚或地昔帕明治疗可抑制ASMase的表达，地昔帕明治疗也可抑制糖尿病大鼠肾脏内质网应激，该结果说明，石榴花多酚可能通过抑制ASMase进而抑制糖尿病大鼠肾脏内质网应激，从而阻碍糖尿病肾病疾病进展。

综上所述，石榴花多酚可抑制糖尿病大鼠肾脏ASMase表达和内质网应激，减轻糖尿病大鼠肾损伤。该研究结果有助于进一步了解石榴花多酚在糖尿病肾病中的作用，为糖尿病肾病的治疗提供新的科学资料。