超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中20 种常用兽药残留量的研究

陈锡龙，赵 贵，黄 鑫，谢丽丽，王庆红，孙真峥，杨 强

贵州省兽药饲料检测所，贵州贵阳 550003

0 引言

兽药，是指用于预防、治疗、诊断动物疾病或者有目的地调节动物生理机能的物质[1]。兽药残留是指食品动物使用兽药后，动物产品的任何可食用部分中所有与药物有关的物质残留，包括原型药物或（和）其他代谢产物[2]。牛奶中的兽药残留主要是养殖过程中兽药滥用或使用不当造成的，这种情况可称之为主动行为；不排除少数被动行为可能造成兽药残留超标的情况，如在不知情的情况下使用含有某种非法添加兽药成分的中兽药等。牛奶中兽药残留超标对人体特别是婴幼儿健康有着严重影响，长期食用兽药残留超标的牛奶，可能导致兽药残留蓄积，引起毒害损伤，甚至致畸、致癌[3]。为应对牛奶中兽药残留超标，我国于2019年9月发布的《GB 31650—2019食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定了牛奶中81 种兽药的最大残留限量[4]，进一步完善了国内奶牛有关兽药使用的规范和标准[5]。

兽药残留检测是保障牛奶质量安全的重要手段和措施。但是，由于兽药种类繁多，如果逐一进行检测，则效率低下，且成本高昂，而高通量检测技术可以一次性检测多种兽药残留，省时省力，因此成为当前研究的热点[6]。我国针对牛奶中兽药残留的检测已出台多项相关标准[7~11]。目前，国内外对单类兽药残留的检测技术已日渐成熟，但对多类兽药残留检测的研究则较少，且不够充分。这是由于同时测定多类兽药残留存在较多难点，如兽药种类多、性质差异大，前处理技术无法兼顾所有药物而使回收率、定量下限等不能满足测定要求[12]。

近年来的研究表明，超高效液相色谱-串联质谱测定法在多种类兽药残留检测方面具有明显优势，已成为当前研究的主流。例如，王浩等[13]利用液相色谱－串联质谱测定法测定了牛奶中五类35 种抗生素残留；李宁等[14]开发了牛奶中四类25 种抗生素残留的检测方法；方灵等[15]建立了同时测定牛奶中五类38 种抗生素残留的分析方法；张炯恺[16]建立了高效液相色谱-串联质谱法快速测定乳制品中十类90 种兽药残留量的方法。这些方法的研究为牛奶中多种兽药残留的快速检测提供了重要借鉴和参考，但尚不满足作为检测标准的条件，仍需继续优化和探索。

本文使用乙腈处理牛奶样品并结合超高效液相色谱串联质谱法建立了七类20 种常用兽药在牛奶中残留量的检测方法，取得了满意的结果。20 种兽药包括3 种β-内酰胺类、4 种喹诺酮类、1 种大环内酯类、1 种林可酰胺类、9 种磺胺类、1 种增效剂类和1 种激素类药物，均为使用广泛的兽药。该方法对于牛奶中多类别、多组分兽药残留的分析监测和快速筛查具有良好现实基础和参考价值。

1 材料和方法

1.1 仪器设备

Waters-UPLC Xevo TQ-XS高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源及MassLynx数据处理系统，美国沃特士公司；Denver Instrument TB-215 D型电子分析天平，美国丹佛公司；Mettler Toledo ME802E型电子天平，美国梅特勒-托利多集团公司；FV64全自动智能氮吹仪，广州得泰仪器科技有限公司（Detelogy）：艾卡（IKA MS3）旋涡混合器，德国艾卡-沃克股份两合公司。

1.2 标准物质及试剂

阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、泰乐菌素、环丙沙星、氧氟沙星、达氟沙星、恩诺沙星、林可霉素、甲氧苄啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、地塞米松，中国兽医药品监察所和中国食品药品检定研究院；泰乐菌素A（泰乐菌素残留标志物），TOKU-E公司；甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，德国Merck公司；实验用水为经Milli-Direct-Q8UV-R净化系统（美国Millipore公司）制备的超纯水；试验所用牛奶样品均为实验室检测留样。

1.3 色谱及质谱条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC® HSS T3，1.8 μm，2.1 mm×150 mm。流动相A为0.2%甲酸水溶液，流动相B为0.2%甲酸乙腈。线性梯度洗脱程序：0~0.5 min，10%B；0.5~11.0 min，10%B上升至90%B；11.0~11.50 min，90%B保持0.5 min；11.50~11.60 min，90%B至10%；11.60~14.00 min，10%B保持2.4 min。流速：0.3 mL/min。柱温：40 ℃。样品温度：10 ℃。进样量：2 μL。

1.3.2 质谱测定条件

电喷雾离子源，正离子扫描；多反应监测模式；离子源入口电压：3.5 kV；离子源温度：150 ℃；雾化气流速：550 L/h；21 种化合物质谱采集参数见表1。

表1 21种化合物质谱参数及保留时间

1.4 标准溶液的制备

1.4.1 单标标准储备液的制备

（1）甲氧苄啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、林可霉素、地塞米松单标标准储备液的制备

称取甲氧苄啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲噁唑、林可霉素、地塞米松各约50 mg，需折算为净含量，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解，用甲醇定容，摇匀，配制成各成分净含量为1.0 mg/mL的标准储备溶液，4~8 ℃冰箱中保存。

（2） 磺胺喹噁啉单标标准溶液的制备

称取磺胺喹噁啉约50 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，再加0.1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL使溶解，用甲醇定容，摇匀，得含磺胺喹噁啉浓度约为1.0 mg/mL的标准储备溶液，4 ~8 ℃冰箱中保存。

（3）环丙沙星、氧氟沙星、达氟沙星、恩诺沙星、泰乐菌素单标标准溶液的制备

称取环丙沙星、氧氟沙星、达氟沙星、恩诺沙星、泰乐菌素各约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，配制成各成分净含量为100 μg/mL的标准工作溶液，于-20 ℃以下避光保存。

（4）泰乐菌素A单标标准溶液的制备

称取约5 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，配制成各成分净含量为100 μg/mL的标准工作溶液，于-20 ℃以下避光保存。（5）阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林单标标准溶液的制备

各按净含量称取阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并定容，摇匀，配制成各成分净含量为100 μg/mL的标准工作溶液，因其容易分解，须临用前现配。

1.4.2 混合标准溶液的配制

取各含量为1.0 mg/mL的标准储备溶液各1.00 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容，摇匀，得浓度为10 μg/mL混合标准中间溶液；另取上述混合标准中间溶液1.00 mL，置预先放入适量水的量瓶中，再加入其余含量为100 μg/mL的各标准工作（或贮备）溶液100 μL，加水稀释并定容，摇匀，即得各化合物浓度为100 ng/mL的混合标准工作溶液。

1.4.3 混合标准工作曲线系列溶液的配制

（1）空白样品基质的制备

称取空白牛奶样品2.0 g，按1.6 样品处理方法从“置50 mL离心管中，”开始，一直到“室温氮吹浓缩至约1 mL，取出，涡旋10~30 s”为止，处理所获得的溶液即为空白样品基质。

（2）合标准工作曲线系列溶液的配制

分别将5 份空白样品基质转移到2 mL量瓶中，再分别加入浓度为100 ng/mL的混合标准工作溶液10 μL、20 μL、40 μL、100 μL和200 μL，加水稀释定容，涡旋混匀，即得浓度分别为0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL的混合标准工作曲线系列溶液。

1.5 磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯哒嗪特征离子色谱峰保留时间的确定

因磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯哒嗪互为同分异构体，需要配制各自适合上机测试浓度的单标标准溶液进行测试，以确定其特征离子色谱峰的保留时间，否则易造成识别误判。

1.6 样品的处理

称取2.0 g牛奶样品，置50 mL离心管中，加入4 mL乙腈处理，涡旋10~30 s，10 000 r/min离心5 min，取上清液过Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化，收集洗脱液于10 mL玻璃试管中；残渣加入2 mL乙腈洗涤，洗液过Oasis PRiME HLB固相萃取柱，合并洗脱液，室温氮吹浓缩至约1 mL，取出，涡旋10~30 s，转移至具刻度的10 mL塑料离心管中，加少量水洗涤试管，洗液合并于离心管中，加水稀释至2.0 mL，涡旋，混匀，10 000 r/min离心5 min，取上清液适量过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.7 检出限和定量限

选取适当的空白牛奶样品，按1.4.3（1）空白样品基质的制备方法制得空白样品基质，添加适量的21 种化合物的浓度均为100 ng/mL的混合标准工作溶液，加水定容至2 mL，涡旋混匀后过滤膜，取滤液上机测定。以特征离子质量色谱峰信噪比S/N≥3的浓度为方法检出限，S/N≥10的浓度为方法定量限。

1.8 准确度和精密度

采用标准添加法进行加标回收试验。分别在2.0 g空白牛奶中加入浓度为100 ng/mL的混合标准工作溶液40 μL和200 μL，制得添加量为2.0 μg/kg和10.0 μg/kg的阳性添加样品，按1.6 样品处理方法处理后上机测定，每个添加水平分别作5 个平行，每个平行进样2 针。计算平均回收率和相对标准偏差，考察方法的准确度和精密度。

1.9 实际样品的测定

对51 批实验室中留样的牛奶样品进行了检测。

1.10 泰乐菌素残留物的检测

因《GB31650—2019食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》中规定泰乐菌素的残留标志物为泰乐菌素A，故本研究同时考察了泰乐菌素及其残留标志物泰乐菌素A的添加回收及检测情况。

2 结果与讨论

2.1 线性范围

按1.4.3混合标准工作曲线系列溶液的配制方法配制21 种化合物混合标准工作系列溶液上机测定。21 种化合物混合标准溶液（2 ng/mL）总离子流图见图1，21 种化合物的出峰顺序和保留时间见表1。21 种化合物分离度良好，响应灵敏。以各化合物定量离子色谱峰峰面积为纵坐标，其相应质量浓度为横坐标，绘制21 种化合物的线性回归方程。结果表明：21 种化合物在0.5~10.0 ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.991。21 种化合物的线性回归方程及相关系数数据见表2。

图1 21种化合物混合标准溶液（2 ng/mL）总离子流图

2.2 检出限和定量限

采用空白基质添加目标化合物的方法，以特征离子质量色谱峰信噪比S/N≥3的浓度为方法检出限，S/N≥10的浓度为方法定量限，该方法的检出限为0.02~0.4 μg/kg；定量限为0.05~1.2 μg/kg。各化合物的检出限和定量限数据见表2。空白样品图谱见图2。

表2 21 种化合物线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

图2 牛奶空白样品总离子流图

2.3 准确度和精密度

采用标准添加法进行加标回收试验。按照1.8的方法，制得添加量为2.0 μg/kg和10.0 μg/kg的阳性添加样品，按1.6样品处理方法处理后上机测定。阳性添加牛奶样品总离子流图见图3。按内标法计算含量，求得21 种化合物的平均回收率为60.6%～93.2%，相对标准偏差为0.8%~17.9%，各化合物的回收率及相对标准偏差数据见表3。

表3 21种化合物在阳性添加样品中的回收率和相对标准偏差

图3 阳性添加牛奶样品总离子流图（添加量为2.0 μg/kg）

2.4 实际样品的检测

对51 批实验室中留样的牛奶样品进行了检测。结果表明：绝大多数兽药未检出残留，少数兽药虽检出残留，但均未超过国家规定的最大残留限量。

2.5 色谱条件的优化

参考方灵等[15]的研究，选用ACQUITY UPLC ®HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×150 mm）色谱柱对21 种化合物进行分离。使用0.2%甲酸乙腈作为有机相，考察选取0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、5 mmol/L乙酸铵和5 mmol/L甲酸铵作为水相，采用梯度洗脱方式对21 种化合物进行分离，结果表明，选用0.2%甲酸水作为水相时，21 种化合物的分离度和峰形较优。故选用0.2%甲酸水作为水相，用0.2%甲酸乙腈作为有机相。

2.6 质谱条件的优化

方法采用蠕动进样方式向质谱系统注入500 ng/mL的单一标准溶液，确定化合物的最佳质谱条件。各化合物标准溶液经超高效液相色谱流动相带入ESI电离源，进行一级全扫描质谱分析。在正离子模式下对[M+H]+进行子离子扫描，得到主要的离子，并选择响应值高的离子进行碰撞能量优化，最终确定了多反应离子监测的离子对及碰撞能量，建立了相应的质谱参数。特别地，化合物中磺胺对甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶，磺胺氯吡嗪和磺胺氯哒嗪互为同分异构体，建立质谱参数后，分别以浓度为5 ng/mL的上述4 种化合物单标标准溶液通过液相系统经色谱柱注入质谱仪，确定其相应的保留时间，利用保留时间进行定性，从而避免识别误判。

2.7 提取溶剂的选择和前处理条件的优化

牛奶基质复杂，前处理主要是沉淀蛋白和除脂，本研究主要选择乙腈、0.2%的甲酸乙腈和5%的三氯乙酸溶液沉淀牛奶中的蛋白，使用Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化除脂。采用乙腈、0.2%的甲酸乙腈沉淀蛋白，方法简单快捷，省时省力，但研究中发现采用0.2%的甲酸乙腈处理样品后，磺胺类化合物的回收率普遍偏低，一般只有30%~40%，且基质干扰较大，故最终选择用乙腈作为提取溶剂。为充分提取化合物残留，选择用2 mL乙腈洗涤残渣一次，但并非洗涤次数或乙腈使用量越多越好。氮吹浓缩时保持室温不加热为宜，以免较高的温度加速某些化合物的分解。氮吹浓缩至1 mL左右，以除去绝大部分的乙腈即可，继续吹干也需要复溶，且会花费较多的时间。氮吹浓缩后的样品仍含有少量蛋白，直接过滤膜会比较困难，故选择转移定容后离心，反而使处理更加快捷和高效。

2.8 单标标准溶液或贮备液的配制

根据化合物性质的差异，配制单标标准溶液或贮备液时采用了不同的配制方法。例如，对于在甲醇中溶解度为微溶或以上且性质稳定的化合物一般配制为1.0 mg/mL的标准贮备液，以便较长时间保存；对于在甲醇中溶解度为极微溶解或以下且性质稳定的化合物一般配制为100 μg/mL的标准贮备液。对于阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林等在甲醇中容易分解，但在水中相对稳定的化合物，则用水作溶剂临用时现配。个别较昂贵且购买时装量极少的化合物，如泰乐菌素A，则配制为100 μg/mL的标准贮备液。几乎不溶于甲醇或水的磺胺喹噁啉，则加了少量碱性溶液进行溶解处理。混合标准溶液均为现用现配。

3 结论

研究建立的牛奶中20 种常用兽药残留量测定的超高效液相色谱串联质谱法，使用乙腈沉淀蛋白，经Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化除脂，再氮吹浓缩后加水定容离心，上机测定，获得了较满意的结果。方法测定的兽药种类覆盖范围广，且均为使用广泛的兽药，具有较强的针对性。同时，方法前处理简单，方便快捷，准确度和灵敏度高，可作为牛奶中常用兽药残留量的快速筛查和定量方法。