高效液相色谱法在牛奶中磺胺类药物残留检测的应用

高 爽

盘锦检验检测中心，辽宁盘锦 124010

0 引言

乳房炎是影响奶牛持续健康的一类生产性疾病，具有发病率高、复发率高、发病范围广等特点[1]，可引发奶牛乳房炎的病原微生物种类超过150多种，对国内大型奶牛场临床乳房炎病例调查结果显示，大肠埃希氏菌（74.5%）、克雷伯氏菌属（60.9%）、停乳链球菌（59.0%）、金黄色葡萄球菌（55.9%）为其主要病原菌[2]。在实际生产中，为缩短奶牛乳房炎的治疗时间，或治疗奶牛因日采食量大，粗放管理饲喂或误食霉变饲料而出现的肠道感染疾病时，抗菌药物是主要的治疗手段[3]。磺胺类药物是一种人工合成的、以对位氨基苯磺酰胺为基本结构的衍生物，对部分革兰氏阴性菌、多数革兰氏阳性菌和衣原体属等病原菌具有较好的抑制作用，是临床用于治疗奶牛病原菌感染的常用药物之一。

但磺胺类药物与其他抗菌药物相同，长期使用会出现耐药性问题，且随着药剂量增大，出现药物残留问题，甚至引发食用者过敏或中毒。动物源性食品中磺胺类药物残留的检测方法主要有免疫法（如胶体金免疫层析法[4]、酶连免疫吸附法[5]、放射性免疫法[6]等）和理化法（如毛细管电泳法[7]、气相-色谱质谱法[8]、高效液相色谱法[9]等）。理化法的分析准确度要高于免疫法，可降低检测中假阳性率或假阴性率，其中高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）提取难度低，操作简便，回收率和灵敏度均高，是农业农村部规定的重要定量方法之一，在磺胺类药物残留中的检测得到广泛推广和应用。

1 磺胺类药物特点及其检测意义

1.1 磺胺类药物的作用机理

磺胺类药物是一类人工合成的、具有对氨基苯磺酰胺结构的抗菌类药物，不易溶于水，易溶于乙醇、乙腈或丙酮，其钠盐复合物易溶于水。磺胺类药物主要通过抑制敏感菌的叶酸代谢来实现抑菌、杀菌作用。

1.2 磺胺类药物的耐药性

目前临床上有20 余种磺胺类药物，种类繁多[10]。养殖业常用到的磺胺类药物有磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶等[11]。磺胺嘧啶对链球菌治疗效果好，但由于用药时间较长，治疗同时易出现耐药性，其药效也会变弱；磺胺二甲基嘧啶抗菌效果与磺胺嘧啶相似，但药物排泄速度慢；磺胺间甲氧嘧啶的耐药性慢，但长期或大量使用会导致动物出现结晶尿，因此磺胺类药物在使用过程中必须注意用药量和用药时间。一般磺胺类药物以口服方式治疗全身感染时，血液中浓度会在服用后（3±1）h时间段内达到最大值[12]。由于磺胺类药物稳定性较高，在肠道内可维持一定时间的高浓度药效，在抑菌的同时，体内的敏感菌株受到较长时间的选择性抑制，会产生耐药性并大量繁殖，因此在药物治疗过程中会出现随着治疗时间延长，药量逐渐增多的现象。

1.3 磺胺类药的不良反应

磺胺类药物使用不当易出现药物残留问题，用药动物会出现皮疹、药物热等过敏反应，且磺胺类药物对动物肾脏的损害较大，易在动物肾小管内形成结晶，损伤其肾小管，导致其出现尿少、结晶尿、血尿等问题。

1.4 磺胺类药的检测意义

一是降低磺胺类药物对动物机体的伤害。磺胺类药物对病原菌感染的治疗效果较好，许多养殖场（户）会选择用磺胺类药物对奶牛痢疾和乳房炎等疾病进行治疗和预防，但牛羊等反刍动物对磺胺类药物的吸收率最低，药物在体内的代谢时间最长[13]，奶牛在长时间药物治疗后，会使体内病原菌发生基因突变，产生奶药性。为缓解病情，养殖场（户）往往通过增加药量或通过增加其他药物协同作用，增强药效。但前者往往会导致病牛因中毒而出现的肌肉抽搐、四肢麻痹现象，严重的甚至死亡。因此牛奶中磺胺类药物残留的检测可以及时探明产奶牛是否存在药物过量使用问题，若发现，需要及时停药，并通过大量饮水，补充适量碳酸氢钠、维生素B、维生素C等缓解磺胺类药物中毒情况。

二是保障牛奶产品的安全性。饮用含有磺胺类药物残留过多的牛奶可对人体产生不良毒副作用，出现过敏、呕吐、头晕、头痛、排尿紊乱等症状。长期或过量摄入可引发动物和人类免疫功能下降，影响体内核酸的合成[14]，甚至致残、致畸、致癌[15]。因此对牛奶中磺胺类药物进行检测可以保障牛奶产品的安全性，减少其对人体的伤害。

2 HPLC方法在牛奶中磺胺类药物残留检测的应用

2.1 牛奶中磺胺类药物最高残留限量规定

根据《GB 31650—2019 食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定，所有动物源性食品中磺胺类药物最高残留限量为100 μg/kg（除磺胺二甲嘧啶），磺胺二甲嘧啶在牛奶中的最高残留限量为25 μg/kg。美国、欧盟、日本规定牛奶中磺胺类药物的最高残留限量分别为10 μg/L、100 μg/kg、100 μg/kg[16]。

2.2 HPLC方法满足多种磺胺类药物同时检测

HPLC方法对样品的适应性广，通过颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术使样品中的各个组分在最佳的条件下被分离，70%以上的有机化合物均可用HPLC方法进行分析，与传统的气相色谱分析技术相比，其应用范围广；与经典的液体色谱技术相比，其对样品的分析速度、载流速度更快，极大地缩短了样本分离时间，并在一次检测中可同时检测多种物质[17]。王伟等[18]对牛奶中12 种磺胺类药物残留进行检测，不同磺胺类药物的线性关系良好（0～500 μg/kg），相关系数R2＞0.998，12 种磺胺类药物加标回收率在60.6%～111.52%范围波动，RSD值为2.42%～12.66%，同时发现HPLC方法在2 次独立检测结果中的绝对差值小，除重复性好之外，对不同磺胺类药物残留检测的精密度较高，符合《GB-T 27404—2008 实验室质量控制规范 食品理化检测》对磺胺类药物检测要求。赵寅等[19]对牛奶中22 种磺胺类药物残留进行检测，不同磺胺类药物的线性关系良好（50～100 ng/mL），相关系数R2＞0.999，磺胺类药物检出限为4 μg/kg，加标回收率为86.7%～98.2%，RSD值为1.6%～8.4%。由此可见，HPLC方法可满足多种磺胺类药物的同时检测，有效地提高了牛奶中磺胺类药物的检测效率，适用于牛奶样品中多种磺胺类药物的检测分析。

2.3 HPLC方法与其他检测方法的比较优势

HPLC操作过程中，其色谱柱可重复使用，降低了检测成本，同时在检测过程可通过自动化操作节约人力、减少人为误差，提高整个检测结果的精确度。孔庆德[20]对牛乳中磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、磺胺间甲基嘧啶（SMM）4 种药物残留进行检测，结果发现美国分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）方法的平均添加回收率为52.55～82.87%，CV值为6.79%～9.91%；HPLC方法的平均添加回收率为69.40%～123.50%，RSD值为1.5%～4.2%，可见本次检测结果中HPLC方法的分析精准度优于AOAC方法，同时HPLC在检测时可以使用比AOAC法较短的色谱柱，减少了磷酸盐缓冲液使用时对色谱柱的损伤，避免检测条件转换时对色谱图的影响，使得整个检测分析操作更为简便；4 种磺胺类药物检出限值：SDZ、SMR、SMZ为0.010 mg/L、SMM为0.015 mg/L，均符合国内外对磺胺类药物的最高残留限量规定。

3 HPLC方法在牛奶中磺胺类药物残留检测的优化

3.1 提取方法优化

牛奶是一种以蛋白质为主要基质的产品。HPLC方法检测时样品在液液萃取或固相萃取时分层后会出现许多白色物质，进而降低回收率，影响检测精密度。曹雪琴等[21]对HPLC检测样品前处理方法进行优化，以沉淀蛋白法代替液液萃取法，选择5%高氯酸溶液为蛋白质沉淀剂，其离心回收上清液清澈，30 min可以完成整个进样分析，缩短前处理时间，10 种磺胺类药物的平均回收率为81.6%～105%，不同磺胺类药物的线性关系良好（0.1～0.2 μg/mL），相关系数R2为0.9921～0.9999，可在牛奶中磺胺类药物残留的快速筛查中进行应用。王露等[22]选用石墨烯复合材料进行磁性固相萃取，以HPLC检测牛奶中SMR、磺胺甲二唑（SMTZ）、磺胺异唑（SIZ）、磺胺多辛（SDX）4 种药物残留，不同磺胺类药物的加标回收率在96.2%～105.0%，RSD值为1.8～3.9，该方法下牛奶样品的损失程度小，灵敏度高，SMR、SMTZ、SIZ、SDX检出限分别为0.02 μg/L、0.036 μg/L、0.046 μg/L、0.05 μg/L，相比C18、氨基固相萃取小柱、多壁碱纳米管，磁性固相萃取法对样本的富集倍数高，检出限低，适合于微量磺胺类药物的检测。

3.2 流动相优化

HPLC流动相内加入一定量的酸性物质有利于磺胺类药物的电离，促进色谱柱内硅胶硅醇基的质子化，减少与磺胺类药物间的相互作用，以保证检测器检测时检测信号连续，避免出现拖尾峰。邵金良等[23]比较了4 种不同的流动相对13 种不同磺胺药物的色谱分离行为，结果发现甲酸溶液-乙腈体系无法很好分离磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲基嘧啶，冰乙酸溶液-乙腈体系在增减冰乙酸溶液浓度后仍无法实现磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪的基线分离，磷酸/三乙胺溶液-乙腈体系无法很好分离磺胺嘧啶、磺胺噻唑药物，其余分离的磺胺类药物的峰型较差，基线波动较大，而磷酸溶液-乙腈体系不仅可分离13 种磺胺类药物，且获得的峰型对称、尖锐，是一种相对稳定且分离效果较好的流动相。

3.3 检测器优化

紫外和荧光检测器均属于HPLC常用检测器。紫外检测器可检测核酸、氨基酸、蛋白质、多天等多种物质，但其线性范围宽，温度感应较为迟钝；荧光检测器检测灵敏度高，但只能检测带有荧光的有机化合物。段婕等[24]对牛奶中磺胺脒（SGD）、SDZ、磺胺噻唑（STZ）、SMZ4 种药物残留进行检测，发现以Ag（Ⅲ）-Luminol化学发光体系作为HPLC的新型检测器比传统的紫外、二极管阵列、荧光检测器更为灵敏，且仪器的运行成本较低，线性范围宽，结果表明SGD、SDZ、STZ、SMZ检出限分别0.15 μg/mL、0.96 μg/mL、1.10 μg/mL、1.50 μg/mL，4 种磺胺类药物加标回收率为81.0%～101.5%。

4 结语

HPLC检测方法具有分辨率强、重复性能好、检测速度快、操作简便等优点，可适用于牛奶中不同磺胺类药物同时检测，在检测过程中可通过优化提取方法、流动相和检测器等色谱条件来提高检测分析精准度。但由于磺胺类药物的化学结构类似，HPLC方法检测时仍易受到基质污染，出现定量偏差和色谱分离度不高等问题，因此在今后的检测中除了继续优化色谱条件外，还可以进行HPLC联用分析，通过多种检测方法共用，实现磺胺类药物的精准定量，进而保障食用牛奶及其相关制品的安全性。