基于UPLC-ABTS-PDA-Triple TOF/MS的辣木叶中抗氧化活性成分在线筛选

甘小娜，李廷钊，2，李波，2*

1.安利（中国）研发中心，上海 201203；2.安利（中国）植物研发中心，江苏 无锡 214145

辣木为辣木科辣木属落叶乔木辣木Moringa oleiferaLam.，起源于印度和非洲，主要分布于世界各地的热带和亚热带地区[1-2]。辣木营养特点突出，高纤维、高蛋白（氨基酸）、低脂肪，且富含维生素和矿物质，被称为“素食黄金”“生命之树”[3-4]。辣木叶不仅具有较高的营养价值，其药理作用也备受关注。近年来，化学成分研究发现辣木叶含有黄酮、酚酸、硫苷、多糖等类化合物[5-9]，具有良好的抗炎、抗菌、抗肿瘤、调血脂、降血糖、免疫调节等活性[10-14]。辣木于20 世纪60 年代被引进中国，目前在我国台湾、云南、海南等地均有种植，并于2012 年11月12日被批准为新资源食品。

自由基在体内可氧化糖类和脂质，使蛋白变性、酶失活，从而引发动脉硬化、高血压、肿瘤等多种疾病[15]，因此，清除机体多余的自由基对治疗相关疾病具有重要作用。目前已有不少文献从清除自由基、抵抗光氧化损伤、抑制脂质过氧化等方面对辣木的抗氧化活性进行报道[12,16-17]，但大多是从其提取物的角度进行评估，关于单体成分的研究相对较少。在线活性分析系统突破传统天然成分活性分析的流程，集色谱分离与活性筛选于一体，具有方便快捷的优点，已被应用于多种植物的活性成分快速筛选[18]。2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）是一种过氧化氢酶的底物，经氧化后生成的自由基溶液对反应体系具有较高的灵敏度，近年来被广泛应用于抗氧化活性的评估。本研究采用谱效结合的方法，使用超高效液相色谱-ABTS-二极管阵列检测器-四级杆飞行时间质谱法（UPLC-ABTSPDA-Triple TOF/MS）实现辣木叶中清除自由基活性物质的快速筛选（图1），为辣木叶活性成分研究及后期更好的开发利用提供物质基础。

图1 辣木叶中清除自由基活性物质在线筛选系统示意图

1 材料

1.1 仪器

液质联用系统：1290 型超高效液相色谱仪（包括自动进样器、四元泵、柱温箱和紫外检测器，安捷伦科技有限公司）串联AB Sciex Triple TOF®4600型高分辨质谱（Sciex 公司）；WF-600EHT 型超声波清洗机（宁波海曙五方超声设备有限公司）；XS2051/10 型万分之一电子天平、MS3002S 型电子分析天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）；柱后反应系统（包括溶剂管理器Reagent Manager、温度控制模块Temperature Control Module Ⅱ和柱后反应模块Post Column Reaction Module，Waters公司）。

1.2 试药

辣木叶购自云南西双版纳，由安利（中国）研发中心李波博士鉴定为辣木科植物辣木Moringa oleiferaLam.的叶，编号为SHRD-LMY，存放于安利（中国）研发中心样品库；对照品绿原酸（批号：6361，纯度≥99.4%）、新绿原酸（批号：3209，纯度：99.3%）、隐绿原酸（批号：3208，纯度≥98%）、维采宁-2（批号：3922，纯度≥99.3%）、芦丁（批号：5932，纯度≥98.5%）、异牡荆素（批号：7449，纯度≥99.3%）、牡荆素（批号：3593，纯度≥99.9%）、异荭草苷（批号：4044，纯度≥99.9%）、异槲皮苷（批号：8029，纯度≥99.0%）、紫云英苷（批号：7346，纯度≥98.7%）均购于上海诗丹德公司；色谱纯甲醇和乙腈均购于德国Merck 公司；分析纯乙醇购于General-Reagent 公司；磷酸盐缓冲液（PBS，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；色谱纯甲酸（美国Honeywell 公司）；对照品水溶性维生素E（Trolox）（批 号：P1656511，纯 度≥98.0%）、ABTS、过硫酸钾[K2(SO4)2]均购于Adamas Reagent公司；超纯水采用美国密理博Milli-Q 型超纯水机制备。

2 方法

2.1 辣木叶提取物抗氧化活性成分的鉴定

2.1.1 供试品溶液的制备 取辣木叶样品50 g，加10 倍量超纯水浸泡1 h 后水浴回流提取1.5 h，趁热滤过，残渣再加8 倍量超纯水提取1 h，趁热滤过，合并2 次滤液，低温真空浓缩至一定体积，然后进行冷冻干燥，得辣木叶的水提取物（得率为19.4%）。精密称取辣木叶提取物25 mg，加50%甲醇10 mL，超声提取10 min，滤过，即得。

2.1.2 ABTS 自由基溶液的制备 ABTS 自由基溶液的制备参考本课题组前期建立的方法[19]，取适量ABTS 和K2(SO4)2进行反应，最终得到在729 nm 波长下吸光度值为0.70±0.02的自由基溶液。

2.1.3 色谱条件 Kromasil 100-5 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.1%乙酸水溶液，流动相B为0.1%乙酸乙腈溶液，梯度洗脱（0～18 min，11%～13%B；18～36 min，13%～30%B；36～43 min，30%～70%B；43～52 min，70%～90%B；52～60 min，90%～11%B）；柱温为30 ℃；检测波长分别为327、729 nm；流速为0.6 mL·min-1；进样体积为3 μL。

2.1.4 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为ESI-模式，一级质谱参数扫描范围为m/z50～1800；离子源气体1 压力为344.7 kPa；离子源气体2压力为344.7 kPa；气帘气压力为241.3 kPa；喷雾电压为-4500 kV；离子源温度为500 ℃；去簇电压为100 V；碰撞能量为10 eV；二级质谱参数扫描范围为m/z50～1250；去簇电压为100 V；碰撞能量为±40 eV。

2.1.5 柱后反应系统条件 反应圈温度为37.5 ℃；流速为0.3 mL·min-1。

2.1.6 辣木叶中抗氧化活性成分的鉴定 按照图1进行进样分析，通过路径A 得到辣木叶的指纹图谱及质谱信息，结合文献和对照品信息对其中的化合物进行结构鉴定；通过路径B 得到辣木叶中的在线抗氧化图谱，与指纹图谱保留时间进行对比，推断辣木叶中的抗氧化活性成分。

2.2 活性化合物验证

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取Trolox对照品粉末适量，加甲醇稀释成质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg·mL-1的系列溶液，待用。

2.2.2 化合物单体及提取物的配制 精密称取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、芦丁和异槲皮苷对照品适量，分别加甲醇配成0.3 mg·mL-1的溶液；取辣木叶水提物适量，加超纯水配成3 mg·mL-1的溶液，超声提取15 min，滤过，待用。

2.2.3 吸光度的测定 取待测样品30 μL，加ABTS自由基溶液5 mL，暗处反应15 min，取200 μL转移至96孔板，于729 nm波长处读取吸光度。

2.2.4 Trolox 当量抗氧化能力（TEAC）值的计算 ABTS自由基清除活性用TEAC值来评价。以对照品Trolox 的质量浓度为横坐标（X），以相对吸光度值（即空白溶液的吸光度值与对照品的吸光度值的差值）为纵坐标（Y），得到标准曲线方程；按照公式（1）～（2）计算TEAC值。

式中，b为对照品Trolox 的质量浓度-吸光度标准曲线方程中的截距，k为该方程的斜率，A0为空白溶液的吸光度值，As为待测样品的吸光度值，C为待测样品的质量浓度。

2.2.5 清除率的计算 辣木叶中化合物的抗氧化能力以其对自由基的清除率来衡量，按公式（3）计算。

式中，HO为辣木叶中化合物在波长327 nm 下的峰高，HS为其清除ABTS 自由基后于波长729 nm 下形成的负吸收峰峰高。

3 结果

3.1 辣木叶提取物化学成分的鉴定

采用UPLC-Q-TOF/MS，根据样品多级质谱信息，结合天然产物高分辨质谱数据库及相关文献，部分化合物采用对照品进行比对，对辣木叶样品进行分析，鉴定出21 个化合物（表1、图2），主要为硫苷、苯丙素和黄酮类等化合物，其中黄酮又包括碳苷黄酮和氧苷黄酮。

图2 辣木叶提取物的质谱基峰离子色谱图

表1 辣木叶样品主要成分鉴定结果

3.2 抗氧化活性成分的确定

供试品溶液经路径B，在柱后衍生系统中与自由基溶液反应后，由PDA 记录色谱信号，有自由基清除活性的化合物在729 nm 波长下有负吸收峰，见图3。由图3可知，化合物新绿原酸、隐绿原酸、芦丁、异槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)具有自由基清除活性。

图3 辣木叶水提物UPLC图和在线抗氧化图谱

3.3 清除率的计算

计算得到辣木叶中各主要活性化合物对自由基的清除能力，见图4。3 个苯丙素类化合物新绿原酸、绿原酸和隐绿原酸的清除率分别2.00、2.03、1.90，3个黄酮类化合物芦丁、异槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷) 的清除率分别为2.97、2.89、2.98。

图4 辣木叶中各主要活性化合物的自由基清除率（,n=3）

3.4 活性化合物的验证

以对照品Trolox 的质量浓度为横坐标，以相对吸光度值为纵坐标，得到标准曲线方程为Y=0.365 4X-0.004 9(r=0.999 8）。以公式（2）计算各待测样品的TEAC值，结果见图5。

图5 辣木叶提取物及各化合物样品的TEAC值（,n=3）

4 讨论

本研究通过UPLC-Q-TOF/MS 从辣木叶中共鉴定出化合物21个，其中包括黄酮类化合物13个（黄酮氧苷9 个、黄酮碳苷4 个）、苯丙素类化合物4 个、硫苷类化合物4 个。运用在线抗氧化活性成分快速分析方法鉴定了6 个主要的抗氧化活性成分，其中包括3 个苯丙素类化合物（新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸）和3 个黄酮类化合物[芦丁、异槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)]。在以ABTS 自由基作为抗氧化筛选试剂时，硫苷类化合物和碳苷黄酮抗氧化活性较低，可能是这类化合物的酚羟基数目、立体结构和电性因素不利其发挥清除ABTS 自由基的作用[27]；而苯丙素类化合物和以槲皮素为苷元的黄酮类化合物均表现出较好的抗氧化活性，这可能与化合物的结构及酚羟基数目有关。

本研究参考文献[28]对活性化合物的自由基清除率进行了计算，结果发现同类型化合物之间自由基清除率差异不大；在不同类型化合物之间，由于最大吸收波长差异较大，使其在相同质量浓度同一波长下的正峰高呈现较大差异，因此用该方法对不同结构类型化合物的自由基清除活性进行比较可能不太准确；继而本研究采用线下活性评价方法对各化合物的ABTS 自由基清除活性进行验证比较，研究结果显示其抗氧化活性为异槲皮苷＞芦丁＞Trolox＞新绿原酸＞绿原酸＞隐绿原酸。本研究为辣木叶天然产物中抗氧化活性成分的研究提供了物质基础。