宏基因组二代测序技术在儿童包裹性脓胸诊疗过程中的应用价值

杨燕霞，王 欣，李淑华，柳小平

(西北民族大学 甘肃省第二人民医院，甘肃 兰州 730030)

包裹性脓胸(Encapsulated Empyema)是因多种原因引起的胸膜腔被致病微生物入侵，在慢性期或机化期渗出的纤维素使得脏壁层胸膜增厚显著，腔隙狭窄且脓液黏稠，即脏层胸膜和肺被机化的纤维素包裹[1].儿童因气管支气管较成人短而狭窄，血管丰富，软骨柔软，缺乏弹性支撑，纤毛运动弱而清除能力差，易发生呼吸道感染.此外,儿童辅助性T细胞暂时性低下，分泌性IgA、IgG含量低微，溶菌素、干扰素、补体数量和活性不足，使得患儿在基础病基础上并发包裹性脓胸[2].宏基因组的二代测序技术作为新兴病原微生物快速检测手段，具有高通量、测序迅速及覆盖面广的特点，在潜在病原体和特殊病原体检测中发挥着重要作用[3].

1 资料和方法

1.1 研究对象

2019年1月至2020年12月间甘肃省第二人民医院呼吸科和儿科收治的包裹性脓胸患儿.根据《临床诊疗指南——胸外科分册》(中华医学会编著，人民卫生出版社)标准，确定儿童包裹性脓胸依据：①患儿有发热、胸痛、咳嗽、咳痰、气短、食欲不振和全身不适等，伴有乏力、贫血、低蛋白血症等.②体征：患侧肋间隙狭窄，胸廓下陷，呼吸活动度减小，纵膈向患侧移位，语音震颤减弱，听诊呼吸音减弱或消失，脊柱侧弯，杵状指.③影像学检查：X线检查可见胸腔积液引起的致密影，多成密度增强的毛玻璃状模糊阴影，肋隔间模糊变钝，纵膈患侧移位，膈肌升高.④在X线定位和B超指引下进行胸腔穿刺，胸腔积液细菌图片或细菌培养阳性.收集研究对象的一般人口学资料、临床资料和影像学资料，48例确诊为儿童包裹性脓胸患者，男22例、女19例，中位年龄5.0(0.7～14)岁.本研究得到甘肃省第二人民医院科研伦理委员会批准.

1.2 方法

1.2.1 取样

胸腔镜下胸膜活检：根据患儿情况选择吸入麻醉、静脉麻醉或静吸复合麻醉;切口位置经B超引导定位于包裹腔外病变相对轻且易进入胸腔的肋间为切口位置,避免直接进入包裹腔内影响手术视野清晰.对脓液腔部位进行活检，取壁层胸膜、膈肌黏膜或病变组织.多部位取材，数量为6～10块放置于样品袋内[4].

1.2.2 mNGS检测

在提取完成后，实验室使用QubitTM荧光定量仪对核酸进行定量，使用NanoDropTM分光光度计检测核酸纯度，使用琼脂糖凝胶电泳检测核酸片段的完整性或降解程度[5].文库制备过程包括DNA打断、接头连接、PCR扩增等过程.在文库制备完成，测序之前，采用QubitTM荧光定量仪对文库进行定量，采用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库片段大小进行质控.质控合格数据需要通过生物信息学分析方法进一步过滤，去除低质量的序列和人源宿主序列[6].经过上述过滤后的序列与病原数据库中的参考序列进行比对，得到最终病原比对结果，包括病原体的比对序列数、相对丰度、基因组覆盖度和深度等参数(其中检出序列数：比对过程中，如果一条序列只能唯一精确比对至单一基因组，定义该序列为特异性序列[7].基因组覆盖度：检出序列覆盖到的基因组长度占物种基因组总长度的比例[8]).mNGS检测的阳性标准：①对于分枝杆菌和嗜肺军团菌、真菌、支原体、病毒和寄生虫，mNGS检测到的菌种特异性序列数≥1为阳性.②对于细菌(不包括分枝杆菌和嗜肺军团菌)，mNGS检测到的特异性序列数≥3为阳性[9].

1.2.3 统计学分析

2 结果

2.1 mNGS检测儿童包裹性脓胸的感染病原微生物组成

注：(a)感染病原微生物种类比例；(b)混合感染中各细菌比例；(c)混合感染中各病毒比例；(d)其他

将收集的48例患儿包裹性脓胸进行mNGS检测，结果所示：如图1(a)所示，由单一细菌引起的有6例(14.63%)，由单一真菌引起的有2例(4.88%)，由单一病毒引起的有5例(12.20%).混合感染的有28例(68.29%)，混合感染中病原菌有9例，细菌-病毒型有12例，细菌-真菌型2例，病毒-真菌型2例，病毒-病毒型3例.如图1(b)所示，混合感染中各细菌比例：肺炎链球菌、铜绿假单胞菌为20.93%，粪肠球菌、嗜肺军团菌为13.95%(肺炎链球菌、铜绿假单胞菌为20.93%、粪肠球菌、嗜肺军团菌为13.95%).如图1(c)所示,混合感染中各病毒比例：人类疱疹病毒比例61.90%、为最高，人腺病毒和EB 病毒为14.29%.如图1(c)所示,其他感染病原体中耶氏肺孢子菌及念珠菌感染比例较高，分别为50.0%和33.33%，黄曲霉菌为8.33%，鹦鹉热衣原体为8.33%(比例最低).

2.2 儿童包裹性脓胸感染病原微生物和可疑病原微生物的基因覆盖度梯度

如表1所示，利用mNGS检测48例包裹性脓胸的患儿感染病原体和可疑病原体，其基因覆盖度结果显示：细菌种属中肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、鲍氏不动杆菌和结核分支杆菌的基因组覆盖度相对较高(P<0.05)；病毒种属中人类疱疹病毒、EB病毒、小细环病毒基因组覆盖度相对较高(P<0.05)；黄曲霉菌、耶氏肺孢子菌、念珠菌、鹦鹉热衣原体基因组覆盖度也相对较高(P<0.05).

表1 mNGS检测出感染病原体和可疑病原体的基因覆盖度梯度

2.3 mNGS样本阳性影响因素分析

如表2所示，48例包裹性脓胸患儿的mNGS样本以临床参考正常值作为标准，按照性别、年龄、白细胞数量、C反应蛋白含量(CRP)、降钙素原含量(PCT)、淋巴细胞比例以及中性粒细胞比例进行影响因素分组，结果显示以上因素均不会对患儿mNGS感染性病原体检出造成影响(P>0.05).

表2 mNGS样本阳性影响因素的单因素分析

3 讨论

本研究以48例包裹性脓胸患儿为研究对象，利用宏基因二代测序技术对胸腔镜下所得的样本进行检测分析，得出病原体的比对序列数、相对丰度、基因组覆盖度和深度等相关参数，获得了儿童包裹性脓胸感染病原微生物的组成特点，不同病原体感染常见菌株或毒株种属以及类型.根据病例资料统计与分析发现，患儿年龄、性别以及血液检查指标均对mNGS检测结果的阳性检出率没有影响.由此可以说明,宏基因二代测序技术在诊治儿童包裹性脓胸优势凸显：①高效性：宏基因组测序技术不依赖于传统的微生物培养，无需特异性扩增，速度快、灵敏度高，对于新发现致病微生物、耐药病原微生物所致包裹性脓胸病例有较高的检出率；②精确度高，无偏倚：样本数据经过质控以及生物信息学分析，去除低质量序列和人源宿主序列，排除了不同病原体定植竞争生存干扰的影响，使得感染病原体的分类分型更加精确.③覆盖面广，适用性强：检出序列数低的可疑病原体、环境中常见的机会致病菌、常见院内感染菌以及具有可致病性的人体定植菌等可辅助临床医生规范用药和调整治疗方案，能有效针对儿童这一特殊人群采取正确的医疗措施.

随着检测感染病原体宏基因组二代测序技术普及，2020年11月15日发布了《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》，建立了中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范[10].本文依据上述共识的专家意见，从临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面对儿童包裹性脓胸进行探究，旨在探究儿童包裹性脓胸的发病特点和感染病原微生物特征，以求指导临床实践.

3.1 根据包裹性脓胸的疾病特征选择mNGS样本种类和方法

胸膜是覆盖在胸膜腔内表面的一层薄膜，由结缔组织和纤维弹力组织支持的间皮细胞层组成.小儿发生脓胸时，脓液白细胞增多，纤维蛋白附着于胸膜形成纤维板，分隔脓腔成多房状，如果仅通过单纯穿刺引流并不能彻底清除病灶内黏稠脓液，纤维板机化会形成包裹性脓胸，反复感染，影响小儿呼吸功能[11].因此在儿童包裹性脓胸的mNGS样本选择时可以考虑患儿排出的痰液、血液、胸腔积液、病灶组织、支气管肺泡灌洗液甚至严重感染侵及脑部的脑脊液.但通过既往研究查阅，如DUAN，H X等人[12]利用宏基因测序技术和传统检测方法对收集的109例患者支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腔液以及脑脊液样本进行分组比较发现，mNGS的敏感性比传统检测方法高，尤其在血液，支气管肺泡灌洗液和痰液样本中，mNGS阳性感染病原体的拷贝浓度与疾病的严重程度，住院天数和死亡率密切相关.LI，H N等人[13]采用mNGS检测肺活检组织的感染病原体分别与组织病理学方法和传统培养方法进行对比，发现mNGS在检测肺活检组织样本感染病原体细菌的灵敏性高于传统培养，在检测真菌灵敏性方面优于组织病理学.结合临床内科，采用胸腔镜方法取活检组织，最终样本类型选择病灶组织(包含脓液和血液).

3.2 通过mNGS检测分析儿童包裹性脓胸感染病原体特点

目前研究表明，mNGS检测的灵敏性明显优于传统病原检测，特别对混合病原体感染情况，如FANG，X W等人[14]通过对收集的72例呼吸机相关性肺炎患者支气管肺泡灌洗液的mNGS和常规检测进行分析发现，mNGS阳性样本检出率明显高于常规检测，且在病毒和细菌混合感染检测方面显示出明显优势.WANG，J H等人[15]通过mNGS和常规检测分析鉴定了55例肺部感染病例，其中36例为混合感染，并按照混合感染中最常见的病原体优化了肺部真菌感染的诊断指标.本研究结果显示，儿童包裹性脓胸感染病原体复杂，其中由单一细菌引起的有6例(14.63%)，由单一真菌引起的有2例(4.88%)，由单一病毒引起的有5例(12.20%).混合感染的有28例(68.29%)，混合感染中病原菌感染9例，细菌-病毒型感染12例，细菌-真菌型感染2例，病毒-真菌型感染2例，病毒-病毒型感染3例.

3.3 儿童包裹性脓胸常见病原体和特殊病原体mNGS高效检出性

宏基因组二代检测技术基于Illumina测序平台的高通量测序[16]，通过微生物专用数据库进行比对分析，经过智能化算法获得致病微生物种属信息，鉴定样本中存在的致病微生物.可检测范围包括基因组序列中已知的细菌、病毒、真菌、寄生虫.LIU，X等人[17]通过对疑似和确诊的311名肺结核病人进行mNGS、半巢式全自动实时荧光定量PCR检测(Xpert MTB/RIF)和培养发现，mNGS、Xpert和培养物在结核分枝杆菌复合体和其他病原体完全匹配度比例很高，说明基于传统检测方法综合mNGS可以高质量地增加结核分枝杆菌复合体的检出率.本研究通过48例患儿感染病原体和可疑病原体的基因覆盖度分析得出：细菌种属中以肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、鲍氏不动杆菌和结核分支杆菌检出效能最高；病毒种属中人类疱疹病毒、EB病毒、小细环病毒检出效能最高；黄曲霉菌、耶氏肺孢子菌、念珠菌、鹦鹉热衣原体等特殊病原体检出效能最高，这给儿童包裹性脓胸的早期经验性用药提供了临床参考资料，有利于帮助制定临床治疗策略和调整治疗计划.

3.4 儿童包裹性脓胸病例特征对mNGS检出率影响分析

既往研究发现，儿童相关感染病原体检出率会受病例的发热情况、住院时间、血液检测指标、用药情况等因素影响.HUANG，H等人[18]通过对75例小儿腺病毒性肺炎进行mNGS检测发现，腺病毒7型引起的小儿重症腺病毒性肺炎死亡率最高，其中患儿的发热时长、白介素-1含量、氧合指数、乳酸脱氢酶含量等均能对检出阳性率造成影响.但本研究通过对患儿病例资料相关指标统计分析发现，在儿童包裹性脓胸病例特征中，患儿年龄、性别血清学相关指标均不是mNGS检出阳性率的独立影响因素.

4 本研究偏差解释、不足之处和深入探究设想

1)根据《中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识》，对于呼吸道感染者，若3天内未通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐进行宏基因组二代测序.本研究搜集病例资料时没有收集是否采取经验性用药资料，也未对抗生素是否可作为影响因素进行探究[19].由于本研究病例样本量收集较为困难，在今后工作中还应进行大样本验证研究.

2)48例包裹性脓胸病例资料中以血液病为原发病的患儿有9例，以重症肺炎为原发病的患儿有22例，以肺部感染为原发病的患儿有10例，以不明原因出现肺部阴影的患儿7例.进行mNGS阳性样本影响因素分析以及感染病原体和可疑病原体基因覆盖度检测时会因原发病的特点而造成统计资料出现偏倚，因此在后续病例数据收集整理时可进行分组，从而探究不同原发病对于该疾病感染病原体的影响.分析讨论宏基因组二代测序技术对儿童包裹性脓胸诊疗有较高的应用价值，有待研究者进行更深入研究和挖掘.