防治马铃薯腐烂茎线虫病的植物源药剂筛选

彭静文，赵远征，王 真，王玉凤，张 妞，王 东，周洪友

（1. 内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2. 内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；3. 乌兰察布市农林科学研究所，内蒙古 乌兰察布 012000）

马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）是一类重要的植物病原线虫[1]，其为多食性线虫，寄主范围广、取食部位多样，在植物地上部分和地下部分均可寄生，也可依靠土壤中的真菌存活。马铃薯腐烂茎线虫主要危害马铃薯块根、块茎等组织，致使马铃薯品质和产量严重下降[2]。近年来，随着内蒙古马铃薯种植面积逐年扩大，种植区域高密度种植、连作，土壤中虫源数量不断增加，病害发生率逐年上升，腐烂茎线虫病问题日益突出，严重制约着马铃薯相关产业的发展[2‐3]。

目前，化学防治是防控线虫病害的重要手段，但长期使用易引起人畜中毒、农药残留污染环境等问题，还会引起有害生物产生抗药性以及对非靶标生物具有高毒性[4‐5]。植物源农药在环境中易降解且对非靶标生物安全，符合当前人类发展现代农药所追求的目标[5]，是综合治理线虫环节中的重要措施。王宏宝等[6]研究表明，5%印楝素乳油与40%锌硫磷复合使用可有效防治黄瓜根结线虫，且对黄瓜生产安全，可有效提高黄瓜产量；舒洁等[7]研究发现，3 种生防菌发酵液（有效活菌数≥3.0 亿个/mL）与1%苦参印楝素稀释液复配，对番茄根结线虫防治效果较好，可显著提高番茄生物量。目前，从植物中已分离得到多种类型的杀线虫活性化学物质，如生物碱类、萜类、异硫氰酸酯和硫代葡萄糖苷类、酚类等，不同类型化合物具有不同的骨架结构，杀虫机制也不同[8‐9]。植物源农药多作为杀虫剂、杀菌剂、杀螨剂等使用，而植物源杀线虫农药则多为植物源农药有效成分与微生物菌剂、熏蒸剂以及非熏蒸类杀线剂的混剂，尚没有专门的植物源杀线虫农药登记[10]。鉴于此，为了进一步开发、利用植物源农药在防治马铃薯腐烂茎线虫上的潜力，采用6 种植物源农药和化学农药20%噻唑膦（阳性对照）对马铃薯腐烂茎线虫进行室内毒力测定、中毒症状观察及体液渗漏测定，研究供试植物源农药对线虫的作用效果和方式，并筛选室内毒力测定效果较好的植物源药剂进行防效试验，为马铃薯腐烂茎线虫的生物防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试线虫：马铃薯腐烂茎线虫分离自马铃薯病薯，并转接于健康的马铃薯薯块进行扩繁，室温条件下保存于内蒙古农业大学园艺与植保学院植物病理研究室。

供试马铃薯：供试马铃薯品种均为希森6号，由乌兰察布市农林科学研究所提供。

供试药剂：6 种供试植物源药剂和1 种化学药剂（CK）信息及配制浓度见表1，等比例稀释后供毒力测定使用。

表1 供试植物源药剂和化学对照药剂信息Tab.1 Information on plant-derived and chemical agents for testing

主要仪器:体视显微镜、生物显微镜、离心机、实验室纯水机、电导率仪等。

1.2 方法

1.2.1 线虫悬浮液的制备 参考郭全新等[11]方法，采用浅盘法从薯块中分离得到线虫，用0.5%次氯酸钠消毒3 min，离心弃上清液，无菌水冲洗3～4次，制成线虫悬浮液，以备毒力测定。

1.2.2 药剂毒力测定 采用直接触杀法[12]。用移液枪吸取配制好的药液和线虫悬浮液至12 孔培养板中，培养板中每孔加入药液2 mL 和线虫悬浮液100 μL（约含线虫60 条）。每个处理重复3 次，以无菌水为阴性对照，20%噻唑膦EW 为阳性对照。用橡皮筋扎紧后放入自封袋，置于25 ℃培养箱，分别在24、48 h 后用体视显微镜检查线虫死亡数量，计算供试植物源药剂的半数致死质量浓度（LC50）。

采用NaOH 刺激法[13]判断线虫是否死亡，即在小皿中加入1 滴1 mol/L NaOH 溶液，3 min 内如果线虫保持不动，则判定为死虫，计算公式：

线虫死亡率=处理线虫死亡数/处理线虫总数×100%，

线虫校正死亡率=（处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率）/（1-对照组线虫死亡率）×100%。

1.2.3 线虫中毒症状观察及体液渗漏测定 选择各药剂处理24 h 后对应的LC50，在25 ℃下处理线虫24 h 后，挑取线虫置于载玻片上，利用USB2.0-Camera 软件在生物学显微镜下观察记录线虫的中毒症状，并与无菌水对照处理的线虫形态进行比较。

配制线虫浓度为2×103条/mL 的悬浮液，用各供试药剂24 h对应的LC50进行处理，试验在25 ℃下进行，采用电导率测定方法[14]于1、3、6、12、24 h测定电导率值。相应对照溶液为不加线虫的各供试药剂（浓度为24 h的LC50），以无菌水为对照，每个处理重复3次。计算公式如下：

线虫悬浮液实际电导率（µS/cm）=线虫悬浮液测定电导率-相应对照溶液电导率。

1.2.4 室内防效试验 试验于2021 年5 月10 日在内蒙古农业大学农场进行。采用盆栽试验，花盆直径36 cm，基质选用土壤和营养土2∶1 混合，180 ℃下灭菌2 h，冷却后使用。根据1.2.2 室内毒力测定结果，采用随机区组设计，设置3 个处理，分别为20%噻唑膦稀释1 000 倍灌根、5%香芹酚AS 稀释1 000 倍灌根及空白对照（CK），药剂灌根均在马铃薯现蕾期进行，每个处理6 次重复。于10 月6 日收获马铃薯并进行调查，调查方法与田间试验调查方法一致，薯块病害分级标准见表2。

表2 薯块病害分级标准Tab.2 Standard for classification of potato diseases

马铃薯腐烂茎线虫接种方法:马铃薯种植30 d后，接种腐烂茎线虫，每盆约为50 000条。

1.2.5 田间防效试验 经室内毒力测定及相关指标筛选，选择5%香芹酚AS、20%噻唑膦EW（阳性对照）于2021 年4 月17 日进行田间试验，试验地位于内蒙古自治区赤峰市喀喇沁旗锦山镇，试验采用完全随机区组设计，每垄长5 m，垄宽1.5 m，株距0.2 m，每垄100 株。试验共设3 个处理：5%香芹酚AS 稀释1 000 倍，1 000 mL/株灌根；20%噻唑膦EW稀释1 000倍，1 000 mL/株灌根；对照（CK）用清水处理。每个处理5次重复。各药剂均在马铃薯现蕾期进行灌根处理，并在马铃薯收获后取样测定相关数据。

田间试验调查方法：植株生长110 d 进行收获，将收获的马铃薯装入袋中并做好标记。参照刘霞霞等[15]的方法，对马铃薯腐烂茎线虫病地下部进行调查，将马铃薯清洗干净后横切，按分级标准（表2）进行分级，记录各级别薯块数及健康薯质量。计算各小区病情指数、发病率和健康薯产量，综合评价药剂对马铃薯腐烂茎线虫病的防治效果。计算公式：

发病率=病薯数/调查总数×100%，

病情指数=∑（各级病薯数×各级代表值）/（调查总数×最高代表值）×100，

防治效果=（对照病薯数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。

1.3 数据分析

采用Excel 2016 和IBM SPSS statistics 26 软件进行概率回归分析，求得6 种植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫的毒力回归方程、相关系数及LC50，并用Duncan’s新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 6种植物源药剂对马铃薯腐烂茎线虫的室内毒力测定

如表3、4 所示，6 种供试植物源药剂分别处理马铃薯腐烂茎线虫24 h 和48 h 后，随处理时间延长各药剂对马铃薯腐烂茎线虫抑制作用不断增强。其中5%香芹酚AS 的毒力最强，处理马铃薯腐烂茎线虫24 h 和48 h，LC50分别为39.542 mg/L 和36.541 mg/L；0.5%藜芦碱SL 对马铃薯腐烂茎线虫的毒力次之，处理24 h和48 h，LC50分别为66.951 mg/L和44.640 mg/L。5%桉油精AS 对马铃薯腐烂茎线虫的毒力最差，LC50分别为1 138.057 mg/L 和703.34 mg/L。1% 蛇床子EW、1.3% 苦参碱SL 和0.3%印楝素EC 处理马铃薯腐烂茎线虫48 h的毒力明显高于处理24 h，与0.3%印楝素EC 处理马铃薯腐烂茎线虫24 h 相比，其处理48 h，LC50减小至33.5%。

表3 6种植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫的毒力测定（24 h）Tab.3 Toxicity of six plant pesticides to Ditylenchus destructor（24 h）

表4 6 种植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫的毒力测定（48 h）Tab.4 Toxicity of six plant pesticides to Ditylenchus destructor（48 h）

2.2 马铃薯腐烂茎线虫中毒形态观察

供试药剂处理马铃薯腐烂茎线虫24 h 后，线虫行为和形态与对照（无菌水处理）相比均发生显著变化。其中，5%香芹酚AS 和5%桉油精EC 处理马铃薯腐烂茎线虫对线虫的影响效果相似，最初12 h虫体僵直并在细胞培养板中出现聚集现象，死亡线虫虫体内出现异常泡状物或空腔，并伴有虫体内含物溢出现象（图1）；20%噻唑膦EW（CK）、0.3%印楝素EC、1%蛇床子EW、1.3%苦参碱AS 和0.5%藜芦碱SL处理的马铃薯腐烂茎线虫的行为、形态较为相似，处理12 h 线虫活动迟缓，24 h 后虫体死亡并僵直，但体内未出现空腔或泡状结构。

图1 显微镜下植物源药剂处理线虫效果（24 h）Fig.1 Microscopic image of botanical pesticides treating Ditylenchus destructor（24 h）

2.3 药剂对线虫体液渗漏的影响

如图2 所示，药剂处理马铃薯腐烂茎线虫24 h后，线虫悬浮液电导率均显著高于无菌水对照（P<0.05）。0.5%藜芦碱、1%蛇床子、5%桉油精、1.3%苦参碱处理马铃薯腐烂茎线虫1～6 h，线虫悬浮液电导率急剧上升，而后趋于平缓；而20%噻唑膦EW（CK）、5%香芹酚AS 处理马铃薯腐烂茎线虫1～12 h线虫悬浮液电导率急剧上升，12～24 h 线虫悬浮液电导率仍处于上升趋势，但较1～12 h 平缓。24 h时，5%香芹酚AS 处理线虫悬浮液电导率最高，为70.40µS/cm，比无菌水对照增加70.34%；0.3%印楝素处理的线虫悬浮液电导率最低，为45.26 µS/cm，比无菌水对照增加35.71%。各药剂处理后线虫悬浮液电导率变化均表现为随时间延长而增大，24 h时线虫悬浮液电导率由大到小依次是5%香芹酚AS>20%噻唑膦EW（CK）>1%蛇床子EW>0.5%藜芦碱SL>1.3%苦参碱AS>5%桉油精EC>0.3%印楝素EC。

图2 植物源农药对马铃薯腐烂茎线虫体液渗漏的影响Fig.2 Effects of botanical pesticides on fluid leakage of Ditylenchus destructor

2.4 5%香芹酚对马铃薯腐烂茎线虫病的室内防效

室内防效测定结果（表5）表明，利用5%香芹酚AS进行灌根处理，马铃薯腐烂茎线虫病发病率和病情指数分别为22.32%和8.19，较空白对照（61.07%和23.90）均显著降低，防效达到65.73%；5%香芹酚AS 处理发病率和病情指数显著低于化学药剂20%噻唑膦EW 处理（13.07%和3.27），防治效果低于20%噻唑膦EW处理（86.32%）。

表5 5%香芹酚AS对马铃薯腐烂茎线虫病的室内防治效果Tab.5 Indoor control effect of carvacrol 5%AS on Ditylenchus destructor

2.5 5%香芹酚对马铃薯腐烂茎线虫病的田间防效

利用5%香芹酚AS 对马铃薯腐烂茎线虫病进行田间防效试验。试验结果（表6）表明，马铃薯经5%香芹酚AS 灌根处理，发病率、病情指数和产量分别为24.44%、7.06 和18 758.39 kg/hm2，CK（清水处理）分别为42.60%、15.20 和16 283.36 kg/hm2。马铃薯经20%噻唑膦EW 灌根处理后发病率、病情指数和产量分别为16.60%、5.87 和22 208.40 kg/hm2。5%香芹酚处理马铃薯腐烂茎线虫病发病率、病情指数与20%噻唑膦处理差异不显著，均显著低于CK（清水处理）。可见，5%香芹酚AS可有效防控马铃薯腐烂茎线虫病，防效为53.55%。

表6 5%香芹酚AS对马铃薯腐烂茎线虫病的田间防治效果Tab.6 Field control effect of carvacrol 5%AS on Ditylenchus destructor

3 结论与讨论

植物源农药作为新型环保农药，近年来一直是线虫病害防治的研究热点。基于快速发展的分离分析技术和地球上几十万种丰富的植物资源，植物源农药具有对非靶标生物安全、不易破坏生态平衡、活性成分作用方式特异等特点[5]。香芹酚作为一种植物源农药，对马铃薯晚疫病[16]、葡萄霜霉病[17]、玉米叶螨[18]等作物病虫害有良好的防治作用，本试验研究发现，5%香芹酚AS 对马铃薯腐烂茎线虫具有较高的毒杀作用，其作用24 h和48 h后，LC50分别为39.542 mg/L 和36.541 mg/L，其对腐烂茎线虫的作用机制将在后续试验中研究，并且有必要继续开展田间防效试验。

藜芦碱是一种具有胃毒和触杀作用的植物源杀虫剂，对人畜毒性低、残留低、药效持久，主要用于防治蚜虫[19]、红蜘蛛[20]、小绿叶蝉[21]等作物地上害虫；藜芦碱防治植物病原线虫研究较少，目前仅有2.4%藜芦碱·阿维AS 在番茄移栽后灌根处理可有效防治番茄根结线虫[22]的报道。本研究表明，0.5%藜芦碱SL 对马铃薯腐烂茎线虫也具有一定的毒杀作用，作用24 h 和48 h 后，LC50分别为66.951 mg/L和44.640 mg/L。此外，0.3%印楝素EC 对马铃薯腐烂茎线虫表现出较高毒力，处理24 h 和48 h 对马铃薯腐烂茎线虫的LC50分别为133.525 mg/L 和44.748 mg/L，这与多位学者的报道结果较为一致：颜珣等[23]研究发现，印楝素在高使用量（0.810 mg/m2）下对线虫的致死作用明显，且处理时间在3 周以上时可显著提高线虫死亡率；徐瑛等[24]发现，0.3%印楝素乳油和2%阿维菌素乳油对松材线虫的毒力相当。苦参碱是常用于线虫病害防控的药剂。刘晓宇等[25]研究发现，0.3%苦参碱水剂防效远高于10%噻唑膦对照，可有效防控番茄根结线虫；熊彩云等[26]发现，1.3%苦参碱对松材线虫有一定毒力，LC50为2.501 mg/L，与本试验结果较为一致。

本研究中，植物源药剂处理马铃薯腐烂茎线虫后对线虫行为、形态具有显著影响，经药剂处理后，马铃薯腐烂茎线虫行动迟缓，死后线虫虫体僵直，5%香芹酚AS 和5%桉油精EC 处理后，线虫体内出现泡状物，这与多位学者的报道结果较为一致：郭群群[8]报道了从无花果和独活中分离得到的活性成分对松材线虫行为及形态的影响，结果表明，处理后的线虫与对照相比，活动迟缓、身体严重蜷曲，随时间推移，身体逐渐展开，最终虫体趋于僵直，线虫死后虫体内出现异常泡状物或空腔。张淑玲[3]研究发现，不同药剂作用于马铃薯腐烂茎线虫时，线虫表现出僵直、行动迟缓、假死等状态。线虫经药剂处理后所表现出的行为形态差异，可能与杀线剂对线虫的作用机制不同有关，今后有必要进一步开展植物源药剂杀线机制的研究，为马铃薯腐烂茎线虫的防控提供依据。线虫的体壁由表皮层和下皮层组成，能够允许水自由通过，但对各种离子和分子则有不同的选择作用。祁之秋等[27]研究表明，二硫氰基甲烷处理后的线虫悬浮液电导率显著增高，且药剂浓度越高，悬浮液电导率越大。本研究发现，经多种植物源药剂处理后线虫悬浮液电导率均显著高于无菌水对照，这与多位学者的报道结果较为一致。例如，白春明等[14]报道，无机化合物处理南方根结线虫J2后，线虫悬浮液的电导率均比清水对照增加。药剂作用于线虫体壁，使内容物外泄导致电导率升高线虫死亡，还是通过口针进入肠道破坏了线虫肠道结构，引起体液外渗导致线虫死亡，尚待进一步研究。

马铃薯腐烂茎线虫病的防治以使用噻唑膦、棉隆和辛硫磷等化学药剂为主。噻唑膦颗粒剂常在定植前拌土施用，种植中期使用噻唑膦水乳剂随滴灌冲施，用量随意。化学农药噻唑膦在种植区的滥用、超浓度使用，造成农药残留、线虫抗药性增强[14]。基于化学杀线剂的使用现状，本试验测定了5%香芹酚对马铃薯腐烂茎线虫病的防效。室内防效试验发现，5%香芹酚AS 可有效防治马铃薯腐烂茎线虫病，防治效果达到65.73%；20%噻唑膦EW（阳性对照）对马铃薯腐烂茎线虫也具有较好的防治效果，防效可达86.32%。关丽萍等[28]将植物源农药烟碱·苦参碱制成微胶囊悬浮剂，有效延长了药剂的持效期，并且降低了氧化和光解的速度；魏芸霞等[29]报道，噻唑膦能在作物根内较长时间维持足够的药物浓度，从而杀死线虫，较低浓度下也能阻碍线虫的活动和繁殖。5%香芹酚AS 防效低于噻唑膦，可能是香芹酚水剂施用后受阳光和微生物分解，活性成分被降解，持效期缩短。因此，有必要开发植物源农药新剂型或将其与化学农药进行混配，有效降低化学农药的使用剂量、提高植物源农药的有效性。田间防效试验表明，5%香芹酚AS 与20%噻唑膦EW 对马铃薯腐烂茎线虫的防治效果差异不显著；但与室内防效相比，20%噻唑膦EW 的防效下降明显，这可能是由于该地区为腐烂茎线虫高发区，农户长期使用单一化学杀线剂，造成该地区线虫对杀线剂抗药性增强而防效降低。香芹酚作为一种植物源农药在田间防效试验中与化学药剂噻唑膦相当，并且可维护土壤环境的稳定性，可以有效减少化学农药使用量。此外，香芹酚作为一种植物源农药，是非人工合成的天然化学物质，易与环境中其他生物相协调，不易导致腐烂茎线虫产生抗药性。综上所述，5%香芹酚AS 符合马铃薯腐烂茎线虫病绿色防控的需求，可作为马铃薯腐烂茎线虫防治的有效生物药剂，生产上也可搭配其他生物药剂轮换使用，促进马铃薯的可持续高产稳产。