酸性环境对镉胁迫下水稻幼苗生长的影响

任新宇，罗 晟，魏宏宇，程 新

（1. 江西农业大学应用微生物研究所，江西 南昌 330045；2. 江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌 330045）

农田土壤重金属污染关系到农产品质量安全和人类健康。其中，镉（Cd）是对农业生产危害最大的重金属元素之一[1]。环境中过量的Cd 不仅会对农作物生长造成严重伤害，大大降低产量和品质[2]，同时食物中的Cd 会进入人体并在体内逐渐累积且不会排出体外，最终对人体健康产生非常严重的负面影响[3]。水稻是我国主要的粮食作物，Cd 和铅（Pb）是稻米中最主要的健康风险因子[4‐5]。因此，降低稻田土壤重金属尤其是Cd 污染具有重要的现实意义。

土壤中重金属的有效性受土壤性质极显著影响[6]。其中，土壤pH 值是影响重金属生物有效性的重要因素。酸性土壤环境不仅会造成土壤质量和肥力下降，影响作物的生长[7]，同时还会引起重金属离子的活化，提高重金属的生物有效性，进而造成植物的大量吸收[8‐9]，导致中轻度重金属污染农田农产品中Cd、Pb积累[10]。我国南方主要农业生产区为典型的酸性红壤区域，大部分土壤的pH值低于5.5，有些低于5.0 甚至更低，且土壤pH 值有逐年下降的趋势[11‐12]。水稻是我国主要的粮食作物，保障及提高水稻产量对我国粮食安全具有重要意义。目前，关于酸性环境、重金属对水稻生长发育的影响研究主要集中于酸性环境或重金属单一胁迫方面[13‐18]，关于两者的复合胁迫研究较少[19‐21]，仅ALI等[19]研究了pH 值对水稻幼苗Cd 积累的影响，陈利等[20]研究了根际pH值与Cd共同胁迫对超高产杂交稻幼苗光合特性的影响，苏国立等[21]研究了不同pH值条件下Cd 含量对水稻种子萌发和幼苗生长的影响，但其pH 值设置偏碱性。尚未见关于酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗生长影响的系统研究。为此，参考国家二类土壤标准（GB 15618—2018，土壤pH 值小于7.5 时Cd 含量是0.6 mg/kg）添加Cd（CdCl2·2.5 H2O）至质量浓度分别为0、0.3、0.6 mg/L，研究酸性环境（pH 值分别为5.0、6.0、6.8）对Cd 胁迫下水稻幼苗生长发育的影响，以期明确酸性环境与Cd胁迫的互作效应，并为农作物的安全生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试水稻品种为五优308，由广东省金稻种业有限公司提供。选取大且饱满的水稻籽粒，用5%NaClO 浸泡消毒10 min，然后用蒸馏水冲洗5～7 次，于28 ℃蒸馏水中浸泡24 h，沥干水备用[22]。

1.2 试验设计

将消毒好的水稻种子均匀撒在放置有湿润纱布的白瓷盘中，28 ℃恒温暗光催芽48 h，保持纱布湿润。将长势一致的水稻幼苗转移至霍格兰（Hoagland）[23]营养液进行水培，每3 d 更换一次培养液，当水稻幼苗生长至两叶一心（10 d 左右）时，调节营养液pH 值分别为5.0、6.0、6.8（CK），并参考国家二类土壤标准（GB 15618—2018，土壤pH 值小于7.5 时Cd 含量是0.6 mg/kg）添加Cd（CdCl2·2.5 H2O）至质量浓度分别0、0.3、0.6 mg/L。水稻生长30 d 时取样进行相关指标测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 幼苗形态指标 水稻生长30 d 时，随机取样，测定株高、叶长[24]，并使用Winrhizo 根系扫描仪测定根系的总长、表面积、平均直径、总体积、根尖数[25]。

1.3.2 可溶性糖和可溶性蛋白含量 水稻生长30 d 时，取叶片，采用硫酸-蒽酮法测定可溶性糖含量[26]，采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量[27]。

1.3.3 光合色素含量 水稻生长30 d 时，取叶片，研磨成匀浆，以95%乙醇为对照，分别在波长665、649、470 nm 下测定吸光度，计算叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量和类胡萝卜素含量[28]。

1.3.4 根系细胞损伤 水稻生长30 d 时，取根系，根系细胞活性的测定采用伊文思蓝（Evans blue）染色法，在光学显微镜下拍照观察[24]。活性氧的检测采用荧光染色法，用荧光显微镜观察并拍照记录[29]。

1.3.5 过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性、脯氨酸及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量 水稻生长30 d 时，取根系，采用愈创木酚法测定POD 活性[30]，采用磺基水杨酸法测定脯氨酸含量[31]，采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量[32]。

1.3.6 根系傅里叶变换红外光谱分析 水稻生长30 d 时，取根系于烘箱中105 ℃杀青30 min，再于75 ℃干燥48 h，粉碎后过筛，将样品与KBr（光谱纯）混合，采用美国PE Spectrum Two 傅里叶变换红外光谱仪进行特定吸收峰与官能团分析，设置波数为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1[33‐34]。

1.3.7 Cd 含量 水稻生长30 d 时，取叶片和根系，烘干，采用68%硝酸与30%过氧化氢对其进行消化[35]，然后使用原子吸收分光光度计（SP-3530AA，Shanghai Spectrum Instruments Co，Ltd，China）测定样品Cd含量[36]。

1.4 数据处理

试验数据采用DPS 7.05 数据处理系统进行统计分析，采用Origin 2018软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗地上部生长发育的影响

2.1.1 株高、叶长 由表1 可以看出，Cd 抑制水稻幼苗生长发育，且随着Cd 质量浓度增加，这种抑制作用增加。在0.3 mg/L Cd 胁迫下，水稻幼苗的株高、叶长分别较无Cd 胁迫处理降低了25.3%、25.9%；在0.6 mg/L Cd 胁迫下，水稻幼苗的株高、叶长分别较无Cd 胁迫处理降低了32.8%、17.7%。pH值对水稻幼苗生长及Cd 的抑制效应有影响，同一Cd 质量浓度下，水稻幼苗在pH 值6.0 时长势最好，株高最高；总体上以pH 值5.0 时长势最差，株高和叶长均最低。总体来看，Cd对水稻幼苗地上部的生长有明显的抑制效应，弱酸环境（pH 值6.0）可以缓解这种抑制作用，但是当pH 值下降至5.0 时，酸性环境对Cd 胁迫下水稻幼苗叶长的毒害效应明显增强。

表1 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗株高和叶长的影响Tab.1 Effects of acid environment on plant height and leaf length of rice seedlings under Cd stress

2.1.2 叶片中可溶性糖和可溶性蛋白含量 从图1可以看出，在Cd 质量浓度为0～0.3 mg/L 时，水稻叶片中可溶性蛋白含量均以pH 值6.0时最高，但当Cd质量浓度提高至0.6 mg/L 时，可溶性蛋白含量随pH值的降低而逐渐升高，以pH值5.0时最高。在Cd质量浓度为0～0.6 mg/L 时，在同一Cd 质量浓度下，水稻叶片中可溶性糖含量均随pH 值的降低逐渐升高，当pH值为5.0时，可溶性糖含量最高。

图1 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗叶片中可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响Fig.1 Effects of acid environment on soluble sugar and protein contents in leaf of rice seedling under Cd stress

2.1.3 叶片中光合色素含量 由表2 可以看出，Cd对水稻幼苗叶片中光合色素含量的影响在不同pH值条件下不同。当pH 值高于5.0 时，水稻幼苗叶片叶绿素a、b 及总叶绿素含量总体上均随Cd 质量浓度增加而下降；当pH 值为5.0 时，水稻幼苗叶片叶绿素a、b 及总叶绿素含量和类胡萝卜素含量均随Cd 质量浓度增加而增加。在同一Cd 质量浓度下，总体上pH 值对水稻幼苗叶片类胡萝卜素和叶绿素a、b 及总叶绿素含量均有显著的影响。总体来看，当pH 值为6.0 时，水稻幼苗叶片类胡萝卜素和叶绿素a、b及总叶绿素含量最高；当pH 值为5.0时，水稻幼苗叶片类胡萝卜素和叶绿素a、b及总叶绿素含量最低。

表2 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗叶片中光合色素含量的影响Tab.2 Effects of acid environment on photosynthetic pigment content in leaf of rice seedling under Cd stress mg/g

2.2 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗根系生长发育的影响

2.2.1 根系形态 当Cd 质量浓度≤0.3 mg/L 时，水稻幼苗根系的总长、表面积、直径、总体积、根尖数总体上在pH 值6.0 时最高，在pH 值5.0 时最低；当Cd 质量浓度提高至0.6 mg/L 时，上述根系指标均随着pH值降低而略有增加（表3）。

表3 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗根系形态的影响Tab.3 Effects of acid environment on root morphology of rice seedlings under Cd stress

2.2.2 根系细胞损伤 伊文斯蓝染色试验被广泛应用于鉴定细胞活性，染色程度与细胞质膜损伤程度呈正相关。从图2A 可以看出，在Cd（0～0.3 mg/L）胁迫条件下，水稻幼苗根系的染色程度随着pH 值的降低变化不明显，说明随着pH 值的降低水稻幼苗根系细胞质膜损伤无明显变化；当Cd质量浓度提高至0.6 mg/L 时，水稻幼苗根系的染色程度随着pH值的降低而增强，说明随着pH 值的降低水稻幼苗根系细胞质膜损伤程度增加。荧光染色试验结果（图2B）表明，无Cd 条件下，水稻幼苗根系荧光亮度随着pH 值的降低而减弱，说明水稻幼苗根系活性氧含量随着pH值的降低而降低；在0.3～0.6 mg/L Cd胁迫条件下，水稻幼苗根系荧光亮度随着pH 值的降低而增强，说明水稻幼苗根系活性氧含量随着pH值的降低而增加。综上，在Cd 胁迫条件下，酸性环境会增加水稻幼苗根系细胞受损伤程度。

图2 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗根系细胞损伤的影响Fig.2 Effects of acid environment on cell damage in root of rice seedlings under Cd stress

2.2.3 根系POD 活性、脯氨酸及MDA 含量 由图3可以看出，当pH 值高于5.0 时，POD 活性和脯氨酸含量随着Cd 质量浓度的增加而增加，MDA 含量随着Cd质量浓度的增加先增加后降低；当pH 值为5.0时，POD 活性随着Cd 质量浓度的增加先增加后降低，脯氨酸含量随着Cd质量浓度的增加先降低后增加，MDA 含量随着Cd 质量浓度的增加而降低。在0～0.6 mg/L Cd 胁迫条件下，水稻根系POD 活性及MDA 含量总体均随着pH 值的降低而升高。脯氨酸含量在同一Cd质量浓度下随着pH值的降低先降低后升高。综上，在一定质量浓度的Cd 胁迫条件下，酸性环境会加剧Cd对水稻的伤害。

图3 酸性环境对Cd胁迫下水稻幼苗根系POD活性、脯氨酸及MDA含量的影响Fig.3 Effects of acid environment on POD activity，proline and MDA contents in root of rice seedlings under Cd stress

2.2.4 根系傅里叶红外变换光谱分析 由图4 可知，在0.6 mg/L Cd 胁迫条件下，不同pH 值下各特征峰没有出现位移，也无新特征峰出现，特征峰强度也无明显变化；在0～0.3 mg/L Cd 胁迫条件下，1 036～1 065 cm-1、1 638～1 660 cm-1、2 880～2 930 cm-1和3 325～3 430 cm-1等处的特征峰强度随pH 值的变化产生了明显的变化。由此可知，pH 值对0.3 mg/L Cd胁迫条件下水稻根系中脂类和羧酸盐、多肽和蛋白质、碳水化合物含量均产生了明显的影响。

图4 水稻幼苗根系红外吸收图谱Fig.4 Infrared absorption spectrum of rice seedling root

2.3 酸性环境对Cd胁迫下水稻叶片和根系Cd含量的影响

由图5 可以看出，Cd 胁迫对水稻幼苗叶片和根系Cd 含量有显著的影响，水稻幼苗叶片和根系Cd含量总体上均随着外源Cd质量浓度的增加而增加，而且根系Cd含量明显高于叶片。根系Cd含量均随pH 值的降低先降低后升高。在外源Cd质量浓度为0、0.6 mg/L Cd 时，叶片Cd 含量总体上均随着pH 值的降低而增加，说明酸性环境会促进Cd 的吸收；在外源Cd 质量浓度为0.3 mg/L 时，叶片Cd 含量随着pH 值的降低而降低。综上，在一定质量浓度Cd 胁迫下，酸性环境会促进水稻体内Cd的吸收。

图5 酸性环境对Cd胁迫下水稻叶片和根系Cd含量的影响Fig.5 Effects of acid environment on Cd content in rice leaves and roots under Cd stress

3 结论与讨论

酸被认为是对重金属吸收有重要影响的因素之一。生长环境的过分酸化不仅影响植物的生长和生理代谢，同时会活化土壤中的金属元素，从而影响其吸收和在植物体内的积累[37]。ALI 等[19]研究发现，水稻幼苗Cd的摄取很大程度上取决于培养基的pH 值，且在pH 值6.0 条件下根向地上部的Cd 转移量最高；而RAHMAN 等[38]研究结果表明，在低Cd浓度条件下，酸性环境可以显著促进小麦根的生长，减缓Cd 的毒害效应。本研究发现，Cd 胁迫抑制水稻幼苗的生长，而一定程度的弱酸性环境有利于Cd胁迫条件下水稻幼苗的生长，在pH 值6.0时生长最好，这一点可能与水稻属于微嗜酸性的农作物有关。但当pH值下降至5.0时，水稻幼苗生长受Cd胁迫的毒害效应增强。

根系是植物与外界环境接触的第一道防线，是胁迫条件下变化最明显的部位，酸及重金属胁迫均会对植物根系的发育产生显著的影响[39]。本研究结果表明，当Cd 质量浓度≤0.3 mg/L 时，水稻幼苗的根系发育在pH 值6.0 时最好，而在pH 值5.0 时发育最差，根系的总长、表面积、直径、总体积、根尖数总体均最低，水稻根系MDA 含量总体上随着pH 值的降低而增加。同时伊文斯蓝染色等试验的结果也表明，在Cd 质量浓度为0.6 mg/L 时，水稻幼苗根系的损伤程度随着pH值的降低而增强。

综上，酸性环境加剧了Cd对水稻幼苗的毒害效应，这与前人[19，40‐41]研究结果基本一致。我国南方红壤地区的土壤pH 值近年来有逐渐下降的趋势，且很多地方土壤pH 值低于5.0。因此，如何降低酸性环境对Cd 胁迫条件下水稻等农作物的毒害效应将是农业生产要面临的重要挑战。