烟草镰刀菌根腐病防治药剂的筛选

姚晨虓，刘 畅，李小杰，白静科，徐 敏，邱 睿，陈玉国，康业斌，李淑君

（1. 烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室/河南省农业科学院烟草研究所，河南 许昌 461000；2. 河南科技大学园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471023；3. 中国烟草总公司河南省公司，河南 郑州 450018）

我国烟草种植面积和总产量均位居全球第一，是全世界最大的烟草生产国与消费国。随着烟草连作年限的增加，土传病害的危害程度日益加重[1‐2]，以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病镰刀菌（F. solani）[3]为主要致病菌的烟草镰刀菌根腐病在我国大多数烟区发生严重危害，给烟叶生产带来巨大的损失[4]。

化学防治仍是目前烟草根茎类病害最主要、最有效的防治措施，常用药剂有75%甲基硫菌灵可湿性粉剂、50%福美双可湿性粉剂[5]、25%甲霜灵可湿性粉剂[6]、25%甲霜灵可湿性粉剂与65%代森锌可湿性粉剂的复配剂[7]等，通过喷施、灌根或蘸根处理可达到较好的防治效果，但化学防治所带来的药物残留增加、病虫害抗药性增强以及对生物健康的威胁等问题也不容小觑[8‐9]。伴随国家化肥农药“双减”政策和对绿色烟叶、有机烟叶的提倡，安全、无毒、环境友好的生物防治逐渐成为研究热点[10‐11]，微生物农药的使用不仅可以很好地防治田间病害的发生与流行，同时还可以达到一定的植物促生作用[12‐13]，但防治效果较慢，成本较高，且受人为、环境等多种因素的影响也较大，存在不稳定的现象[14]。

为更好地防治烟草镰刀菌根腐病，可通过筛选高效、低毒、低风险的化学杀菌剂和生物杀菌剂进行复配。采用不同作用机制的杀菌剂交替或复配使用，是阻止或延缓病原菌抗药性进一步加剧的主要策略之一[15]。陈志敏[16]对福建烟区烤烟根茎类病害进行药剂筛选和防治试验，发现10%苯醚甲环唑EC 和12.5%腈菌唑EC 及其复配剂对烟草立枯丝核菌、烟草炭疽病菌、烟草根腐尖孢镰刀菌均具有较强的抑制作用；王秋萍等[17]研究发现，甲霜·锰锌和中生菌素与烟草专用肥混合施用对烟草病害具有较好的防治效果，并且可以提高烟叶产量。同时，包衣剂的开发和应用也是尽可能从根源上预防和解决病害问题的主要方法之一，配合复配剂的使用可以极大程度地降低烟草病害在生产中带来的损失。目前，关于烟草镰刀菌根腐病的田间药剂筛选报道较少，而且生物杀菌剂的筛选可为复配剂的开发提供供选药剂。鉴于此，采用菌丝生长速率法测定20种杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的毒力，并通过盆栽试验验证防效，为烟草镰刀菌根腐病田间防治药剂的筛选、轮换交替用药及复配剂的相关研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

供试菌株为烟草行业黄淮烟区烟草病虫害绿色防控重点实验室保存的烟草镰刀菌根腐病主要致病菌尖孢镰刀菌（F.oxysporum）。

1.2 供试药剂

20种供试杀菌剂的具体信息见表1。

表1 供试杀菌剂Tab.1 Test fungicides

续表1 供试杀菌剂Tab.1（Continued） Test fungicides

1.3 供试培养基及培养条件

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：将200 g去皮马铃薯、20 g 葡萄糖、15～20 g 琼脂用蒸馏水熬煮定容至1 000 mL，121 ℃高压灭菌20 min。将病原菌接种于PDA 平板，在相对湿度70%、25 ℃、光周期12 h/12 h的培养箱中培养6～8 d。

1.4 试验方法

1.4.1 不同杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的室内生物活性测定 采用菌丝生长速率法[16]测定20 种杀菌剂对烟草镰刀菌根腐病菌的室内毒力。通过一系列预试验，最终设定如表2 所示的各杀菌剂试验浓度梯度。选用直径为5 mm 的打孔器，打取培养6～8 d 的病原菌菌落边缘制备菌饼，用挑针挑取菌饼分别接种于不同质量浓度药剂平板上，每组处理重复3次，25 ℃倒置培养6～8 d。利用十字交叉法测量菌落平均生长直径，根据病原菌在不同质量浓度药剂平板上的线性生长速率，计算各质量浓度药剂对病原菌的菌丝生长抑制率，并求出各药剂对病原菌的抑制中浓度（EC50）。

表2 20种杀菌剂的毒力测定浓度Tab.2 Concentrations of 20 fungicides used for determination of their toxicity to F.oxysporum

抑制率=[对照组菌丝生长直径（mm）-处理组菌丝生长直径（mm）]/[对照组菌丝生长直径（mm）-菌饼直径（mm）]×100%。

1.4.2 不同杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌室内盆栽防效测定 盆栽药效试验参照文献[18]略有改动。将培养好的带菌麦粒[3]与灭菌基质按体积比（1∶5）混匀，选取4～5叶期长势一致的烟苗移栽，根据室内药剂筛选的EC50值设定盆栽药剂施用浓度，将不同供试药剂的稀释液按每株20 mL 进行灌根，施足水后于28 ℃保湿培养，每处理10株，重复3次，以清水灌根为病原菌对照，以不接种病原菌仅清水灌根为空白对照。接种病原菌15 d 后以株为单位统计发病情况，按照烟草行业标准GB/T 23222—2008[19]进行病害调查和严重度分级，计算发病率、病情指数和相对防效。

1.5 数据处理

用DPS 7.05 软件对数据进行回归分析，计算各处理质量浓度的对数值（X）和菌丝生长抑制率概率值（Y），求出毒力回归方程和相关系数（r），得出杀菌剂的EC50，并得到95%置信区间。采用Excel 2010 软件对数据进行统计，计算各处理病情指数和防治效果。

2 结果与分析

2.1 10种化学杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的毒力

采用菌丝生长速率法测定了10 种高效、低毒、低风险化学杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的毒力。结果（表3）显示，10 种化学杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌均有不同程度的抑制作用，氟啶胺、戊唑醇、苯醚甲环唑和抑霉唑的抑菌效果较好，EC50分别为0.057 1、0.118 7、0.328 0µg/mL 和0.445 9µg/mL，其中以杀菌剂氟啶胺的平板抑制效果最好（图1），可选取这4种杀菌剂进一步开展复配剂组合筛选和包衣剂开发研究。

图1 氟啶胺对烟草尖孢镰刀菌的平板抑制效果Fig.1 The inhibitory effect of fluazinam on F.oxysporum

表3 10种化学杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的毒力Tab.3 Toxicity of ten chemical fungicides to F.oxysporum

其次是嘧菌酯、异菌脲、甲基硫菌灵和啶酰菌胺，EC50依次为8.409 3、8.802 0、8.814 7 µg/mL 和12.483 8 µg/mL，四者可作为备选药剂。抑制效果最差的是烯酰吗啉和嘧霉胺，EC50分别高达133.738 5µg/mL 和228.613 6µg/mL，二者对病原菌的活性较低，因此生产上应避免使用此类药剂防治烟草镰刀菌根腐病以及其他烟草根茎类病害。同时，在烟草种植区选择时还需对前茬作物的用药情况进行调查，避免因此类药剂因连年施用、用药量过大等产生病原菌抗药性或药害。

2.2 10种生物杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的毒力

采用菌丝生长速率法测定10 种高效、无毒（或低毒）、低风险的生物杀菌剂对烟草镰刀菌的毒力，结果（表4）显示，7种生物杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌有较好的抑制作用，其中阿维菌素、香芹酚和芸苔素内酯的抑菌效果最好，EC50分别为10.387 0、18.873 2 µg/mL 和32.343 7 µg/mL。阿维菌素在市场上通常被作为杀虫剂来使用，同时兼具杀菌作用，10种生物杀菌剂中以阿维菌素对烟草尖孢镰刀菌的EC50值最低，平板抑菌效果最好（图2）。其次是乙蒜素和赤霉酸，EC50依次为79.109 4 µg/mL 和87.413 2 µg/mL，二者可作为备选药剂。大蒜油和氨基寡糖素的抑菌效果较差，EC50高达255.127 8µg/mL 和361.824 7 µg/mL。而小檗碱、井冈霉素和甲壳素在250 µg/mL 质量浓度下抑制率分别为34.64%、16.80%、4.76%，抑制效果较差且不稳定。

表4 7种生物杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的毒力Tab.4 Toxicity of seven biological fungicides to F.oxysporum

图2 阿维菌素对烟草尖孢镰刀菌的平板抑制效果Fig.2 The inhibitory effect of avermectin on F.oxysporum

2.3 7种杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的室内防效

由表5可以看出，在杀菌剂室内防效试验中，除香芹酚外的其余6种杀菌剂均对烟草尖孢镰刀菌有不同程度的防治效果。戊唑醇对镰刀菌的相对防效最高，为75.75%，其次是苯醚甲环唑、芸苔素内酯和氟啶胺，相对防效分别为62.12%、62.12%和51.51%（图3）。

图3 部分药剂对烟草尖孢镰刀菌的盆栽防治效果Fig.3 Control effect of some pesticides on F.oxysporum in potted plants

表5 7种杀菌剂对烟草尖孢镰刀菌的室内防效Tab.5 Indoor control effect of seven fungicides against F.oxysporum in tobacco

3 结论与讨论

随着烟草镰刀菌根腐病危害的逐年加重，其受重视程度也开始逐渐增加，目前有关烟草镰刀菌根腐病的药剂筛选报道仍较少。陈志敏[16]测定了4 种药剂对烟草尖孢镰刀菌的毒力，结果发现，10%苯醚甲环唑EC 的EC50为0.370 0 µg/mL，抑制效果最好，与本研究测定的苯醚甲环唑的EC50值（0.328 0µg/mL）基本一致，并且本研究筛选的氟啶胺和戊唑醇的抑制效果（EC50分别为0.057 1、0.118 7 µg/mL）均好于苯醚甲环唑∶腈菌唑（1∶4）复配剂的抑制效果（EC50为0.410 0 µg/mL）。郭敬等[20]报道，烯酰吗啉对烟草疫霉的抑制效果较好，可抑制菌丝生长和孢子囊萌发；但胡燕等[21]研究发现，烯酰吗啉对烟草疫霉敏感菌株继代培养物的抑菌率明显降低，可能形成了高水平的抗性菌株，证明烟草疫霉对烯酰吗啉存在较大的抗性风险。本研究发现，烟草尖孢镰刀菌对烯酰吗啉的敏感性较低，因此，在田间用药时必须注意合理使用，预防烟草主要病原菌高抗水平的产生。

生物杀菌剂的防效相对化学杀菌剂较低，药效较慢，但是有些生物农药具有诱导植物体产生抗性并促进植物生长调节的作用，对环境友好，极具生产、开发潜力[22‐23]。黄阔等[24]研究发现，阿维菌素对烟草根结线虫病的控制效果较好，盆栽防效可达82.97%。本研究发现，阿维菌素具有较好的抑菌能力，开发潜力大。有研究报道，乙蒜素对烟草野火病菌[25]、烟草青枯病菌[26]均有一定的抑制效果。本研究也发现，乙蒜素对烟草尖孢镰刀菌的抑制效果较好，应该提高乙蒜素在烟草病害防治研究与应用中的重视程度。小檗碱对烟草赤星病菌的抑制效果较差[25]，同时会造成烟草细胞变形和质壁分离，线粒体和细胞壁等降解[27]；井冈霉素对烟草赤星病菌的EC50为10 556.58 µg/mL，抑菌能力差[25]。本研究发现，小檗碱和井冈霉素对烟草尖孢镰刀菌的抑菌效果较差，应该注意此类药剂的田间使用。虽然生物源杀菌剂的用药风险低、安全系数高，但是生产上也应该严格规范使用。

由于镰刀菌经常发生形态学性状和致病性方面的变异[28]，所以对于室内盆栽防效试验的稳定性会产生较大影响。本次盆栽试验筛选的杀菌剂，平板抑菌效果均较好，但盆栽试验中发病率整体较高，对试验的相对防效产生了一定的影响，尤其是香芹酚的防效有待进一步验证，同时需对病原菌接种量、药剂施用量和施用次数进行深入细化研究。而且，盆栽防效结果并不能完全代表田间实际防效，药剂在田间的防效还会受到寄主植物、多种病菌及复杂环境条件的综合影响[29]。

本研究结果表明，氟啶胺、戊唑醇、苯醚甲环唑和芸苔素内酯对烟草镰刀菌根腐病主要致病菌的抑制作用较强，室内盆栽防效较好，对于烟草镰刀菌根腐病田间防治的药剂应用和轮换交替用药具有理论指导意义。同时，为进一步选定药剂进行两元复配、三元复配、化学药剂与生物源药剂或生物菌剂的复配奠定基础，也为包衣剂的开发提供新的理论参考，对生产上综合防控烟草镰刀菌根腐病和其他根茎类病害具有重要的实践指导意义和研究价值。