钩藤碱的超声辅助提取及其含量变化

吴顺 孙健鹏 谢丽霞 陈泽阳 张嘉桐 颜彬彬

摘要 [目的]采用正交试验法优选钩藤碱最佳提取工艺，确定钩藤药材最佳采收时期。[方法]以传统外观质量和钩藤碱含量为评价指标，在单因素试验基础上，以料液比、乙醇质量浓度和超声处理时间为影响因素，采用L16（43）正交设计优化提取工艺。通过检测不同采收时期钩藤碱含量的变化，确定最佳采收时期。[结果]钩藤碱最佳提取工艺为料液比1∶20，60%乙醇浸泡1 h，超声处理40 min，80 ℃回流2 h;当年10月—次年2月为钩藤药材的较佳采收时期。[结论]优选出的钩藤碱提取工艺设计合理、结果可靠;确定了钩藤药材的采收时期，为利用湖南钩藤进行饮片生产提供了理论依据。

关键词 钩藤;超声提取;钩藤碱;含量;采收时期

中图分类号 R 284  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2022）12-0158-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.12.040

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Ultrasound-assisted Extraction and Its Content Changes of Rhynchophylline

WU Shun， SUN Jian-peng， XIE Li-xia et al

（School of Life Science and Technology， Central South University of Forestry and Technology， Changsha，Hunan 410018）

Abstract [Objective]The optimal extraction conditions for rhynchophylline from Uncaria tenuifolia were investigated by orthogonal tess method，the optimal harvesting season for crude drugs was confirmed. [Method] Taking traditional appearance quality and rhynchophylline content as evaluation indicators，on the basis of single factor experiment， taking the solid-liquid ratio， ethanol mass concentration and ultrasonic treatment time as influencing factors， L16（43） orthogonal design was adopted to optimize the extraction process.The optimum harvesting period was determined by detecting the changes of rhynchophylline content in different harvesting periods.[Result]The optimal extraction process of rhynchophylline was as follows： solid-liquid ratio of 1∶20， soaking in 60% ethanol for 1 h， ultrasonic treatment for 40 min， and reflux at 80 ℃ for 2 h.The better harvesting time for Uncaria tenuifolia medicinal materials was from the year October to February of the following year. [Conclusion]The selected extraction condition for rhynchophylline was reasonable and dependable;the harvesting season for Uncaria tenuifolia medicinal materials was confirmed and provided the theoretical basis for production of Chinese herbal medicine in Uncaria tenuifolia.

Key words Uncaria tenuifolia;Ultrasonic extraction;Rhynchophylline;Content;Harvesting time

鉤藤为茜草科植物钩藤[Uncaria rhynchophylla（Miq.）Jacks]的干燥带钩茎枝，具有清热平肝、熄风定惊等功效[1]。研究表明，钩藤中的有效成分主要有生物碱类、黄酮类、有机酸类、甾体类、苷类化合物，具有显著的降压、镇静、安眠、解痉等作用，其中具有显著药理作用的主要是以钩藤碱为代表的吲哚类生物碱，临床上主要治疗高血压、癫痫、哮喘等疾病，如方剂羚角钩藤汤、麻黄钩藤散、天麻钩藤饮、泻肝安神汤等[2-5]。

钩藤生长环境中的温度、水分、光照、大气、盐分、养分等都会使其在形态结构和生理生化上发生变化以适应环境，而次生物质则是它适应环境的物质基础。钩藤碱作为钩藤的次生代谢产物，其合成和积累会随着季节的变化而变化[6-8]。该研究以钩藤碱为考察对象，采用正交试验法结合超声处理对钩藤带钩枝条中的钩藤碱进行提取，旨在获得最佳提取工艺;同时，通过采集湖南不同月份的钩藤药材，阐明其有效成分钩藤碱的动态积累规律，为更好地利用钩藤药材进行饮片生产具有重要意义。C1D07F86-5081-46E3-9087-D860B7D909FA

1 材料与方法

1.1 试验材料 2015年3月种植于中南林业科技大学试验基地的黔钩藤。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1100高效液相色谱仪;电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9030A）;超声洗脱仪（SBZ200）;真空冷冻干燥机（LGJ-25C）。钩藤碱（纯度为98%）标准样品购自上海源叶生物科技有限公司。流动相所用甲醇为色谱纯，试验所用其他试剂均为分析纯。

1.3 样品的采集与干燥

2018—2020年每月15日左右在试验基地采集当年生带钩枝条，共36批。用40 ℃恒温干燥，直至恒重。将干燥后的带钩茎枝分别粉碎过40目筛，备用。

1.4 提取条件的选择

将钩藤生物碱的初始工艺参数设定为乙醇质量浓度60%、超声处理时间30 min、提取温度80 ℃，并固定料液比1∶20（g∶mL）、超声功率300 W。精确称取样品，加入乙醇溶液后，浸泡1 h。置于80 ℃水浴中回流2 h，3 000 r/min，取上清液，真空干燥。在此基础上，进行单因素试验，分别考察超声处理时间（10、20、30、40、50、60 min）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）和乙醇质量浓度（10%、20%、40%、60%、80%、90%）对钩藤粉末中钩藤生物碱提取量的影响，重复3次。固定每次优化的最佳提取条件，再一次按顺序优化筛选其余条件。

根据单因素试验结果，以钩藤碱含量为评价指标，选取料液比（A）、乙醇质量浓度（B）、超声时间（C）为考察因素，按照L16（43）正交表进行正交试验，每个因素取4个水平，考察最佳提取条件。

1.5 色谱条件

参照黄瑞松等[7]的方法。色谱柱为Waters C18（3.9 mm×150 mm，5 μm）;流动相为甲醇-水（含0.002 mol/L三乙胺，用冰醋酸调pH至7.5）（64∶36）;柱温40 ℃;流速1 mL/min;检测波长254 nm，进样量5 μL。

1.6 供试品中钩藤碱含量的测定

精密称取供试品按照正交试验优化条件进行提取制备，并按“1.5”色谱条件进行钩藤碱含量测定。

1.7 提取物中钩藤碱含量的计算

准确称取一定质量的钩藤提取物，溶解并定容至25 mL，样品进行高效液相色谱检测。按公式w=C×10×YM×1 000进行含量计算，式中，w为粗品中钩藤碱含量（μg/g），C为稀释后溶液质量浓度（μg/g），Y为稀释倍数，M为钩藤碱粗品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 钩藤碱的高效液相色谱检测

精确称取钩藤碱对照品和检测样品适量，加75%甲醇制成约25 mg/L标准品溶液和待测液。按“1.5”色谱条件上样，结果显示（图1），待测样品获得了较好的分离，所得峰型完整，无杂质峰干扰，保留时间在11.5 min左右。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声时间的选择。以1∶20料液比加入60%乙醇，浸泡1 h后，超声处理一定时间，80 ℃水浴中回流2 h。由图2可知，随着超声处理时间的增加，钩藤提取物中钩藤碱含量随之升高。可见反應时间越长，提取越充分，但是当超声时间超过40 min时，提取物中钩藤碱含量趋于稳定，增长较小。考虑到实际生产的效益，因此选定处理时间20、30、40、50 min作为正交试验的4个水平。

2.2.2

料液比的选择。以不同料液比加入60%乙醇，浸泡1 h后，超声处理30 min，在80 ℃水浴中回流2 h。由图3可知，料液比在1∶5～1∶30时，随着溶剂用量的增加钩藤提取物中钩藤碱含量呈增大趋势，当料液比达到1∶30后钩藤提取物中钩藤碱含量反而降低。这表明随着溶剂用量的增加，降低了提取物中有效成分的浓度，不利于工业生产。因此，选定料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40作为正交试验的4个水平。

2.2.3

乙醇质量浓度的选择。由图4可知，乙醇质量浓度为20%～80%时，钩藤提取物中钩藤碱含量较高，乙醇质量浓度为60%时达到最高，大于80%后，钩藤提取物中钩藤碱含量明显下降。由此可见，提取过程中乙醇质量浓度必须适当，过高和过低均会对钩藤提取物中钩藤碱含量造成影响，且过高会增加提取成本。因此选定20%、40%、60%、80%作为正交试验的4个水平。

2.3 钩藤碱提取工艺的正交优化

根据单因素试验结果，得出正交试验的因素和水平（表1）。

根据高效液相色谱检测计算出钩藤提取物中钩藤碱含量，运用SPSS 10.0对结果进行统计比较分析，获得钩藤碱正交最佳提取工艺。由表2可知，影响钩藤碱提取的因素大小依次是C>B>A，但均达到显著水平。钩藤碱最佳提取工艺为A2B3C3，即料液比1∶20，60%乙醇浸泡1 h，超声处理40 min，80 ℃回流2 h。正交试验方差分析表明，按工艺条件进行重复试验，重现性较好。

2.4 钩藤不同采收期钩藤碱变化

据观察，试验基地中的钩藤在每年3月中旬随着气温的升高，逐渐脱离休眠状态，4月初开始发出新芽，5—10月为快速生长时期，10月底枝叶开始变成墨绿，为越冬作准备。

由图5可知，钩藤中钩藤碱的含量在一年中呈动态变化，虽然不同年份表现不同，但总体上来看，都以当年10月—次年2月采集的样品中钩藤碱含量较高，而7—8月样品中钩藤碱含量较低。但从不同年份来看，供试品中钩藤碱含量在不同月份中表现不一，这表明气候条件对钩藤体内次生物质的积累有较大影响。

3 讨论与结论

钩藤生物碱主要为吲哚类生物碱，易溶于氯仿、丙酮、乙醇、苯等溶剂[9-10]，相对于其他有机溶剂，乙醇具有廉价、无毒、安全性高的特点，因此该试验选用乙醇作为提取溶剂。超声波辅助溶剂萃取具有快速、价廉、高效和环保等优势，可以大大缩短提取时间，提高成分提取率。由于此法提取温度相对较低，对某些遇热不稳定、易水解或氧化的中药成分具有较好的保护作用，因而应用范围较广。该研究正交试验优化得到的最佳提取工艺为料液比1∶20，60%乙醇浸泡1 h，超声处理40 min，80 ℃回流2 h，能获得较高含量的钩藤碱提取物，为指导钩藤相关产品的生产提供了科学理论依据。C1D07F86-5081-46E3-9087-D860B7D909FA

钩藤作为一种常绿灌木植物，其药用价值早已得到广泛认可，而关于采收时间则有不同的记载。从前人的研究成果[11-15]来看，不同产地的钩藤，为获得有效成分含量较高的成品药材，其采收时期存在较大的差异。究其原因，可能是由于植物生长的生态环境（如光照、温度、水分等）对有效成分的形成和积累具有较明显的影响所致。从该研究的结果来看，黔钩藤引种至湖南后，气候对其有效成分有一定的影响，但不同年份的变化并不显著，而其采收期则以当年10月—次年2月为最佳。

参考文献

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