QuEChERS超高效液相串联质谱法测定速冻调理肉制品中6种喹诺酮类药物残留量

李毅 张玉洁

摘 要：为快速准确大批量检测速冻调理肉制品中6种喹诺酮类残留量，采用5%甲酸的乙腈溶液提取，ProElut QuE 2 mL Tube进行快速净化，过膜进超高效液相串联质谱仪分析。经实验验证，6种喹诺酮类的线性相关系数均在0.99以上，其中恩诺沙星平均回收率为98.4%～104.2%，环丙沙星平均回收率为79.8%～101.4%，氧氟沙星平均回收率为86.0%～106.5%，培氟沙星平均回收率为78.5%～87.0%，诺氟沙星平均回收率为82.0%～99.3%，洛美沙星平均回收率为86.1%～95.2%。结果表明，该方法简单、快速、准确，适用于速冻调理肉制品中6种喹诺酮类药物残留量的测定。

关键词：喹诺酮类;QuEChERS;速冻调理肉制品

Determination of 6 Quinolones Residues in Quick-Frozen Conditioned Meat Products by Quechers Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

LI Yi1， ZHANG Yujie2

（1.Shandong Zhongzhun Testing Technology Co.， Ltd.， Weihai 264209， China; 2.Weihai Institute of Food and Drug Inspection and Testing， Weihai 264209， China）

Abstract： In order to quickly and accurately detect the residues of 6 quinolones in quick-frozen conditioned meat products in large quantities， 5% formic acid in acetonitrile solution was used for extraction， and ProElut QuE 2 mL Tube was used for rapid purification. It was verified by experiments that the linear correlation coefficients of the six quinolones were all above 0.99， among which the average recovery rate of enrofloxacin was 98.4%～104.2% the average recovery rate of ciprofloxacin was 79.8%～101.4%， and the average recovery rate of ofloxacin was 86.0%～106.5%， the average recovery rate of pefloxacin was 78.5%～87.0%， the average recovery rate of norfloxacin was 82.0%～99.3%， and the average recovery rate of lomefloxacin was 86.1%～95.2%. The results showed that the method was simple， rapid and accurate， and was suitable for the determination of 6 quinolones residues in quick-frozen conditioned meat products.

Keywords： quinolones; QuEChERS; quick frozen conditioned meat products

隨着人们生活节奏的加快，生存压力的增大，速冻调理肉制品以其方便快捷、简单易操作的优势特点进入人们的餐桌并逐步占据主导。速冻调理肉制品是指以畜禽肉为主要原料，经搅拌、调味等工艺加工而成的非即食类肉制品。

喹诺酮类抗生素作为广谱抗菌药物，广泛用于革兰阴性细菌感染的治疗，由于价格低且药效明显而广泛应用于畜禽养殖[1]。喹诺酮类等兽药的安全合理使用，可以降低畜禽发病率与死亡率，促进畜禽生长，但部分养殖户过分追求经济利益、盲目加大用药，导致药物在畜禽体内富集，人食用此类动物组织后，造成人体疾病或对药物产生耐药性，长期摄入可能引起食用者恶心、呕吐、疼痛等胃肠道不适及肠道菌群失调[2];也会引起头痛、头晕、睡眠不良等症状[3];并有潜在的致癌、致畸、致突变风险。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。美国食品药品监督管理局于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。我国也在GB 31650—2019中规定环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星等6种喹诺酮类药物在动物肌肉组织中的最高残留限量为10～500 μg/kg。

喹诺酮类药物在动物组织中的残留分析方法主要有酶联免疫吸附测定法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱分析法。传统方法多采用液液萃取法或者固相萃取法，液液萃取法浪费溶剂，准确度低，若提取溶剂中含有乙腈，旋蒸容易报废且最终会有水分残留，影响最终的定量分析结果;固相萃取法需要经过活化、上样、淋洗、洗脱和氮吹等诸多步骤，消耗时间太长，大批量检测样品时会降低工作效率。本方法基于QuEChERS原理，采用快速过滤柱对样品提取液进行净化。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乙腈（CH3CN），色谱纯，美国FISHER公司;甲酸（CH3COOH），色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司;恩诺沙星（Enrofloxacin），坛墨质检科技股份有限公司;环丙沙星（Ciprofloxacin），坛墨质检科技股份有限公司;氧氟沙星（Ofloxacin），坛墨质检科技股份有限公司;培氟沙星（Pefloxacin），坛墨质检科技股份有限公司;诺氟沙星（Norfloxacin），坛墨质检科技股份有限公司;洛美沙星（Lomefloxacin），坛墨质检科技股份有限公司。6FDA8BEF-9993-46BB-B3EF-B00D1A7FA1E9

1.2 仪器与设备

AB 3500液相色谱质谱联用仪，配电喷雾离子源，美国AB SCIEX公司;SQP电子天平，美国Sartorius公司;超纯水机，法国Millipore公司;移液枪，美国Sartorius公司;高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司;超声波清洗器，昆山美美超声仪器有限公司;涡旋混合器，德国IKA公司;色谱柱：Kinetex C18 100 mm×2.1 mm×2.6 μm。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

准确称取粉碎均匀的速冻牛排样品5.00 g置于50 mL离心管中，加入含5%甲酸的乙腈溶液10 mL，涡旋混合，15 ℃超声15 min。加入2 g氯化钠，涡旋混合90 s，以转速8 500 r/min，温度2 ℃，冷冻离心10 min，取1 mL上清液待净化。将1 mL提取液转移到ProElut QuE 2mL Tube，涡旋30 s，離心后取上清液，加水100 μL，涡旋混合，氮吹至近干，加乙腈-0.1%甲酸水（1∶9）定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，进液相色谱质谱联用仪分析。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。流动相：A 0.1%甲酸溶液，B 乙腈，梯度洗脱，见表1;流速：0.3 mL/min;柱温：40 ℃;进样量：5 ?L。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾（ESI）离子源;扫描方式：正离子扫描;检测方式：多反应监测;电离电压：3 000 V;源温：100 ℃;雾化温度：350 ℃;锥孔气流速：25 L/h;雾化气流速：450 L/h。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

在参考GB/T 21312—2007[4]、农业部1077号公告—1—2008[5]的基础上，首先对质谱参数进行优化，以离子丰度比较大且干扰较小为原则，选择适合的子离子，同时以丰度值较大的子离子作为定量离子。采用多反应监测模式进行分析，表2为该方法获得的最佳质谱检测参数，图1为特征峰。

在优化质谱条件的基础上，进一步优化了流动相比例，最终确定在正离子模式下，以乙腈和0.1%甲酸水为流动相，6种喹诺酮类药物能够在10 min内实现色谱分离，且互不干扰。

2.2 标准工作曲线和检出限

标准贮备液：取喹诺酮类标准品各约100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1 mg/L的喹诺酮类标准贮备液，-20 ℃保存，有效期3个月。

混合标准工作液：取喹诺酮类标准贮备液各1 mL于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度均为100 ng/mL混合标准工作液，现用现配。

标准曲线的制备：取20 μL、50 μL、100 μL、200 μL和400 μL混合标准工作液，用流动相稀释至1 mL配制成浓度为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL和40 ng/mL的系列标准溶液。以特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。所得线性回归方程和相关系数见表3。

将100 ng/mL混合标准工作液稀释至1.00 ng/mL、2.50 ng/mL、5.00 ng/mL后依次添加至样品中，按照上述实验操作进行测定，以3倍信噪比计算检出限，结果见表3。

2.3 精密度

对实验操作样品进行了方法精密度试验，用来保证实验结果的重复性，用加标浓度为5.00 ng/mL的喹诺酮类样品，重复检测6次，结果精密度如表4所示。

2.4 回收试验

按照上述实验步骤对速冻牛排制品进行了3个不同浓度（2.50 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL）的加标回收试验，计算出以下6种喹诺酮类药物的回收率，结果见表5。

3 结论

经多次试验验证，本实验采用的ProElut QuE 2 mL Tube快速净化技术结合超高效液相色谱串联质谱法成功解决了检测大批量样品喹诺酮时面对的时效长、准确度低的问题，对速冻调理肉制品中喹诺酮类药物残留的测定具有重要意义。

参考文献

[1]才凤，赵飞，贾宏新.超高效液相-串联质谱法测定速冻调理肉制品中18种喹诺酮类药物残留量[J].食品安全质量检测学报，2019，10（24）：8456-8461.

[2]李丽莉，罗轶，何颂华，等.高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中8种喹诺酮类药物的残留量[J].中国食品卫生杂志，2012，24（1）：37-40.

[3]李婷.鸡蛋中喹诺酮类兽药残留及检测方法[J].今日畜牧兽医，2022，38（3）：7-8.

[4]国家质量监督检验检疫总局.动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法：GB/T 21312—2007[S].北京：中国标准出版社，2007.

[5]农业部.水产品中17中磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法：农业部1077号公告—1—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.6FDA8BEF-9993-46BB-B3EF-B00D1A7FA1E9