猪德尔塔冠状病毒M蛋白参与病毒诱导IL-8产生的研究

石照蓉，陈建飞，张洪玲，时洪艳，郭龙军，冯 力

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150069）

猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是近年来新发现的猪肠道冠状病毒，该病毒为冠状病毒科δ 冠状病毒属成员[1]。与猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染病胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染类似，PDCoV 感染主要引起仔猪呕吐、腹泻、脱水等主要临床症状，临床上常与PEDV 和TGEV 混合感染，已成为影响猪场仔猪腹泻的重要病原之一[2]。PDCoV 基因组约25.4 kb，编码刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）4 种结构蛋白以及15 种非结构蛋白[3]。研究表明，冠状病毒M 蛋白参与病毒复制整个周期，是病毒复制必不可少的组分[4-5]。病毒感染能够诱导机体产生许多炎性因子，诱导机体炎症反应的发生，从而激活机体的先天性免疫应答，使机体呈抗病毒状态。IL-8 是趋化因子家族成员，由巨噬细胞、单核细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和上皮细胞等分泌，是一种重要的中性粒细胞趋化因子，与肿瘤和癌症的发生密切相关[6-7]。IL-8 作为重要的促炎因子，检测其在体内的表达水平有助于对疾病的严重程度进行预判[7]。然而，PDCoV 感染诱导IL-8 产生的调控机制鲜有报道。鉴于IL-8 对病毒感染后的病理变化及炎症反应具有重要的指导意义，本研究旨在探究PDCoV 感染与宿主细胞IL-8 产生的关系，为深入阐明PDCoV 的致病机制提供研究方向。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料猪睾丸细胞（ST）、猪小肠上皮细胞（IPEC）、HEK 293T 细 胞、PDCoV NH 株（KT336560.1）、IL-8 启动子质粒、pRL-TK 质粒由本实验室保存；胎牛血清购自Gibco 公司；RNA 提取试剂盒、双荧光素酶检测试剂盒购自Axygen 公司；逆转录试剂盒、SYBR Green I 荧光定量试剂盒购自TaKaRa 公司；X-Treme GENETM转染试剂购自Roche公司；鼠抗HA 标签抗体、山羊抗鼠IgG（H&L）-Dy800 购 自Sigma 公 司；FITC 标 记 的 山 羊 抗 鼠IgG 购自Li-Cor Biosciences 公司；PDCoV M 基因PCR 扩增引物和IL-8 mRNA 荧光定量PCR（qPCR）引物由吉林省库美生物技术有限公司合成。

1.2 IL-8 mRNA 转录水平的qPCR 检测将PDCoV以MOI 0.1 和MOI 0.01分别感染单层IPEC细胞和ST细胞，感染后6 h、12 h、24 h 分别收集细胞样品。按照Axygen 公司RNA 提取试剂盒提取总RNA 反转录为cDNA 后作为模板，按照TaKaRa 荧光定量试剂盒说明进行qPCR 检测。用于检测IL-8 mRNA 的qPCR引物序列如下：F：CCACACCACACCACAACCCCAA A/R：TTGTTGCTTCTCAGTTCTCTTCA。

1.3 重组M蛋白的表达、鉴定及其诱导IL-8 mRNA转录水平的qPCR 检测参照GenBank PDCoV 序列（KT336560.1）设计PDCoV M 基因PCR 扩增引物，MF：CGGCTAGCATGAGCGATGGGAGAAT/M-R：CGTC TAGACATATATTTATCAGGGCG。以IPEC 细胞基因组DNA 为模板，经PCR 扩增M 基因并克隆至pCAGGSHA 载体构建重组表达质粒pCAGGS-M。用X-Treme GENETM转染试剂将pCAGGS-M 质粒转染HEK 293T细胞，培养30 h收集细胞样品，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移至PVDF 膜，以鼠源抗HA 抗体（1∶1 000）为一抗，以山羊抗鼠IgG（H&L）-Dy800（1∶500）为二抗，通过western blot 分析M 蛋白表达情况。将HEK 293T 细胞接种于12 孔板，培养过夜后转染pCAGGSM 质粒，转染后24 h，弃去细胞培养液，利用33%丙酮固定30 min，甲醇透膜30 min，5% 脱脂乳封闭1.5 h，以鼠源抗HA 标签抗体（1∶1 000）为一抗，以FITC 标记的山羊抗鼠IgG 为荧光二抗（1∶500），通过间接免疫荧光试验（IFA）检测M 蛋白表达情况。通过上述试验证实pCAGGS-M 质粒在细胞中可正确表达M 蛋白后，将2.0 μg pCAGGS-M 质粒和pCAGGS-HA空载体质粒分别转染IPEC 细胞，转染24 h 后收集细胞样品，RNA 提取及逆转录方法见1.2，并通过qPCR检测IL-8 mRNA 转录水平。

1.4 M 蛋白诱导IL-8 转录水平的双荧光素酶活性分析将IL-8 启动子质粒、pRL-TK 质粒和不同剂量pCAGGS-M 质粒（10 ng、100 ng 和200 ng）共转染HEK 293T 细胞，转染pCAGGS-HA 空载体作为对照。转染后24 h，弃掉细胞上清，按照Axygen 公司双荧光素酶检测试剂盒操作说明，每孔加入60 μL PLB裂解液，置于摇床室温裂解20 min。将20 μL 裂解液样品转入酶标板，加入50 μL LARII 试剂检测萤火虫荧光素酶活性。然后加入50 μL 终止液，检测海肾荧光素酶活性，将萤火虫荧光素酶活性值和海肾萤火虫荧光素酶活性值的比值作为IL-8 启动子的相对活性。

2 结果与讨论

2.1 IL-8 mRNA转录水平的qPCR 检测结果将PDCoV以MOI 0.1 和MOI 0.01 分别感染IPEC 细胞和ST 细胞，感染后不同时间（6 h、12 h 和24 h）收集细胞样品，提取细胞总RNA并反转录成cDNA，通过荧光定量PCR 方法检测细胞IL-8 mRNA 转录水平。结果显示，与未感染组相比，PDCoV 感染IPEC 细胞6 h、12 h 和24 h 诱导IL-8 mRNA 转录水平分别上调3 倍、37 倍和173 倍（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）（图1A），PDCoV感染ST细胞后不同时间IL-8 mRNA转录水平分别上调20倍、19 000倍和48 000倍（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）（图1 B）。炎症因子在病毒感染的早期产生，机体炎症水平异常会刺激机体相关调控机制，本研究选取了病毒感染后6 h、12 h 和24 h 测定IL-8 mRNA 转录情况，发现IL-8 mRNA 水平与感染时间呈现正相关。结果表明PDCoV 感染能够显著诱导宿主细胞IL-8 mRNA 水平的上调。

图1 qPCR检测PDCoV感染IPEC细胞（A）和ST细胞（B）IL-8 mRNA转录水平Fig.1 Detection of the transcription level of IL-8 mRNA in IPEC cells(A)and ST cells(B)infected with PDCoV by qPCR

2.2 重组M 蛋白的表达、鉴定及其诱导IPEC 细胞IL-8 转录水平的qPCR 结果PDCoV 感染后，病毒核酸由宿主模式识别受体（PRR）感知，最终激活宿主的抗病毒反应。抗病毒的炎症反应对于宿主防御病毒感染至关重要。PDCoV M 蛋白参与病毒复制的整个周期，是病毒复制必不可少的组分[5]。为了进一步探究PDCoV 编码的M 蛋白是否能够诱导IL-8 产生，本实验构建pCAGGS-M 真核表达质粒，利用IFA（图2A）以及western blot方法（图2B）均证明M重组蛋白可在细胞中正确表达。将1.5 μg pCAGGS-HA 质粒和pCAGGS-M质粒分别转染IPEC细胞，转染后24 h通过qPCR方法检测IL-8 mRNA转录水平。结果显示，与转染空载体组相比，转染pCAGGS-M能够明显诱导细胞中IL-8 转录水平的上调（约4.3倍，P＜0.05）（图2C）。以上结果表明，PDCoV M蛋白能够诱导细胞IL-8的产生。

图2 Western blot和IFA检测M蛋白表达及qPCR检测M蛋白诱导IL-8 mRNA的转录水平Fig.2 Detection of the M protein expression by western blot and IFA and the transcription level of IL-8 mRNA induced by M protein by qPCR

2.3 M 蛋白诱导IL-8 转录水平的双荧光素酶活性分析为进一步探究PDCoV M 蛋白对IL-8 的调控作用，分别将不同剂量pCAGGS-M 质粒（10 ng、100 ng和200 ng）、IL-8 启动子质粒、pRL-TK 质粒共同转染HEK 293T 细胞，转染pCAGGS-HA 质粒为对照，转染后24 h 后通过双荧光素酶活性分析试验测定PDCoV M 蛋白不同转染剂量对IL-8 启动子的诱导活性。结果显示，与空载体转染组相比，转染10 ng、100 ng 和200 ng pCAGGS-M 质粒的相对荧光素酶活性分别上调了1.9倍、3.8倍和5.7倍（P＜0.05）（图3）。表明随着PDCoV M 蛋白转染剂量增大对IL-8 转录水平的促进作用更加显著。

图3 双荧光素酶活性分析试验测定M蛋白对IL-8转录活性的分析Fig.3 Iuciferase assay for the transcriptional activity of M protein on IL-8

先天性免疫系统是机体防御病原体侵入的第一道防线。宿主利用不同的PRR 识别不同的病原微生物并诱导细胞内的信号网络，引起炎症的发生并以此消灭病原体[8]。趋化因子是一种可以使细胞发生定向迁移的信号蛋白或小分子多肽，可以使白细胞迁移到受损位置引发炎症。IL-8 作为重要的中性粒细胞趋化因子，在机体感染后，能够诱导机体的炎症反应，利于机体消灭病原[7]。本研究表明，PDCoV 感染能够诱导宿主细胞IL-8 mRNA 转录水平上调，进一步研究发现PDCoV M 蛋白能够诱导IL-8 的转录，本研究揭示了PDCoV M 蛋白促进病毒诱导宿主细胞IL-8 的转录并参与宿主细胞IL-8 的产生，为深入解析PDCoV 致病机制提供参考依据。