circ_0011385和miR-330-3p在结肠癌中的表达及其对结肠癌细胞恶性行为的影响

东金花， 吴葆华， 闫丹措

(青海省人民医院消化科， 青海 西宁 810000)

结肠癌是最常见的癌症死亡原因之一，尽管结肠镜检查以及结肠切除术、化学疗法和免疫疗法等诊治方法不断改进，但仍有50%结肠癌患者出现肿瘤复发，5年生存率较低[1]。深入了解结肠癌进展机制有助于寻找有效结肠癌治疗方法。环状RNA(circRNA)是一类环状共价闭合的非编码RNA，目前的研究认为circRNA可作为微小RNA(miRNA)海绵抑制miRNA表达水平和功能作用，并在肿瘤的发生、发展和转移中发挥调控作用[2]。circ_0011385在甲状腺癌中表达上调，并通过负调控miR-361-3p表达促进癌细胞恶性迁移和侵袭能力，抑制细胞凋亡和周期进程[3]。circ_0011385在结肠癌进展的研究仍不清楚。miR-330-3p是一种结直肠癌抑癌miRNA，miR-330-3p靶向BTB-CNC异体同源体1(BACH1)可抑制结直肠癌细胞增殖能力[4]。敲低人类白细胞抗原F反义RNA1(HLA-F-AS1)可上调miR-330-3p进而抑制结直肠癌细胞转移[5]。生物信息学显示miR-330-3p是circ_0011385的潜在靶点，但circ_0011385是否靶向miR-330-3p调控结肠癌进展未见报道。本研究分析了circ_0011385和miR-330-3p在结肠癌组织中的表达情况，分析二者表达与患者临床特征的关系，并探讨circ_0011385靶向miR-330-3p对结肠癌细胞恶性行为的影响，旨在为临床防治结肠癌提供潜在策略。

1 材料与方法

1.1组织来源:选取2018年3月至2020年3月在我院确诊且接受手术治疗的80例结肠癌患者的癌组织和癌旁组织标本，所有样品立体后置于液氮中冷冻，后续保存在-80℃冰箱中。所有参与者术前均未接受放化疗，且都签署书面知情同意书，该研究得到了我院伦理审查委员会的批准。患者的临床特征见表1。

表1 circ_0011385和miR-330-3p的表达与患者临床特征的关系分析

1.2细胞和试剂:SW1116细胞购自上海信裕生物工程公司；胎牛血清(FBS)、青链霉素双抗(P/S)、DMEM培养基购自美国Gibco公司；TRIzol试剂购自北京百奥莱博生物公司；SYBR Premix Ex Taq试剂盒、PrimeScript RT试剂盒购自大连Takara公司；TaqMan miRNA试剂盒购自美国ThermoFisher公司；Transwell小室、Annexin V/PI检测试剂盒购自美国BD公司；荧光素酶重组载体、si-circ_0011385、si-NC、anti-miR-330-3p、anti-miR-NC购自广州锐博生物。

1.3方 法

1.3.1RT-qPCR检测circ_0011385和miR-330-3p表达:TRIzol试剂从80对组织样本提取总RNA后，用PrimeScript RT试剂盒逆转录合成cDNA，用SYBR Premix Ex Taq试剂盒检测circ_0011385表达。采用TaqMan miRNA试剂盒检测miR-330-3p表达。GAPDH和U6分别作为circ_0011385、miR-330-3p的内参，用2-ΔΔCt方法计算circ_0011385、miR-330-3p的相对表达量。miR-330-3p引物序列5'-GCAGAGATTCCGTTGTCGT-3'(上游)，5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'(下游)；U6引物序列5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'(上游)，5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'(下游)；circ_0011385引物序列5′-TGACAACAATGAGCCCTACA-3′(上游)，5′-TTTCCTTGGCACTATACTGG-3′(下游)；GAPDH引物序列5′-TGT TCG TCA TGG GTG TGAAC-3′(上游)，5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′(下游)。

1.3.2细胞培养和分组:SW1116细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基，条件为37℃、95%、CO25%。细胞长至80～90%融合度时加入5mL胰蛋白酶消化3min，1∶3传代。将对数期SW1116细胞按2×104个/孔接种24孔板，用lipofectamine 2000将si-NC、si-circ_0011385、si-circ_0011385+anti-miR-NC、si-circ_0011385+anti-miR-330-3p分别转染50%融合度的细胞，共分为si-NC组、si-circ_0011385组、si-circ_0011385+anti-miR-NC组、si-circ_0011385+anti-miR-330-3p组。培养48h收集细胞，RT-qPCR检测circ_0011385或者miR-330-3p表达水平。

1.3.3双荧光素酶报告实验:circular RNA interactome数据库预测到circ_0011385与miR-330-3p存在结合位点。根据miR-330-3p的预测结合位点扩增circ_0011385的野生型(WT)或突变型(MUT)序列并克隆到pmirGLO载体中，构建重组载体WT-circ_0011385、MUT-circ_0011385。将重组载体与miR-330-3p mimics或miR-NC共转染SW1116细胞，转染48h后检测相对荧光素酶活性。

1.3.4Transwell实验检测SW1116细胞迁移和侵袭:侵袭检测选用包被基质胶的Transwell小室，迁移检测选用未包被基质胶的Transwell小室。将5×104个转染48h SW1116细胞重悬在200 μL无血清培养液并接种于Transwell上腔室，24孔板下腔室加入500 μL完全培养液。将24孔培养板置于37℃温箱中培养24h。用4%多聚甲醛固定穿膜细胞，双蒸水冲洗3次，干燥后用0.5%结晶紫染色。显微镜下观察细胞侵袭或迁移情况。

1.3.5流式细胞术检测SW1116细胞凋亡:胰酶消化转染48h细胞，用预冷PBS洗涤两次，1×结合缓冲液重悬后，用Annexin V/PI检测试剂盒染色。流式细胞仪检测凋亡细胞。

2 结 果

2.1circ_0011385和miR-330-3p在结肠癌组织中的表达:结肠癌组织与癌旁组织比较circ_0011385表达水平显著升高(P<0.05)，miR-330-3p表达水平显著降低(P<0.05)，见图1A和1B。结肠癌组织中circ_0011385和miR-330-3p表达呈负相关关系(r=-0.8924)，见图1C。

2.2circ_0011385和miR-330-3p的表达与患者临床指标的关系:circ_0011385和miR-330-3p的表达与结肠癌患者的年龄、肿瘤大小无相关性(P>0.05)，但与分化程度、TNM分期、淋巴结转移显著相关(P<0.05)，见表1。

图1 结肠癌组织中circ_0011385和miR-330-3p的表达及相关性分析

2.3circ_0011385靶向调控miR-330-3p:circular RNA interactome在线分析显示circ_0011385和miR-330-3p存在互补序列，见图2A。共转染WT-circ_0011385和miR-330-3p mimics组SW1116细胞的相对荧光素酶活性显著低于共转染WT-circ_0011385和miR-NC组(P<0.05)，见图2B。与si-NC组比较，si-circ_0011385组SW1116细胞circ_0011385表达水平显著降低(P<0.05)，而miR-330-3p表达水平显著升高(P<0.05)，见图2C-D。

图2 circ_0011385靶向调控miR-330-3p

2.4circ_0011385和miR-330-3p对SW1116迁移、侵袭的影响:与si-NC组比较，si-circ_0011385组SW1116细胞迁移数、迁移数显著减少(P<0.05)；与si-circ_0011385+anti-miR-NC组比较，si-circ_0011385+anti-miR-330-3p组SW1116细胞迁移数、迁移数显著增多(P<0.05)，见图3。

图3 circ_0011385和miR-330-3p对SW1116迁移、侵袭的检测

2.5circ_0011385和miR-330-3p对SW1116凋亡的影响:与si-NC组比较，si-circ_0011385组SW1116细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与si-circ_0011385+anti-miR-NC组比较，si-circ_0011385+anti-miR-330-3p组SW1116细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，见图4。

图4 circ_0011385和miR-330-3p对SW1116凋亡的检测

3 讨 论

多项研究揭示了circRNA和miRNA表达失调在结肠癌的生长和转移中的关键作用。Zhou等[6]研究证实circ_100859表达水平与TNM分期、组织学分级相关，对结肠癌患者具有较高的诊断和预后价值，circ_100859靶向miR-219促进结肠癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。He等[7]发现circRNA-ACAP2通过调控hsa-miR-21-5p/Tiam1轴促进结肠癌细胞恶性行为。本研究检测到circ_0011385在结肠癌组织中表达增加，而miR-330-3p表达减少，且circ_0011385和miR-330-3p表达呈负相关关系。进一步分析显示，circ_0011385和miR-330-3p的表达与结肠癌患者的年龄、肿瘤大小无相关性，但与分化程度、TNM分期、淋巴结转移显著相关，这提示circ_0011385和miR-330-3p差异表达参与结肠癌进展。近年研究表明部分circRNA具有特定miRNA的结合位点，circRNA可吸附miRNA进而间接调控miRNA对靶mRNA表达的影响[8]，如circ_000166通过下调miR-330-5p、上调Ets样蛋白1(ELK1)促进结肠癌细胞转移和侵袭[9]。本研究证实miR-330-3p是circ_0011385的直接靶点，这提示circ_0011385可能靶向miR-330-3p调控结肠癌进展。

研究报道circ_0011385靶向miR-149-5p参与促进宫颈癌细胞的恶性生物学行为。为探讨circ_0011385在结肠癌中的功能，本研究结果显示，沉默circ_0011385表达显著降低SW1116细胞迁移数和侵袭数，增加细胞凋亡率，这表明沉默circ_0011385可抑制结肠癌细胞迁移和侵袭行为并诱导细胞凋亡，circ_0011385在结肠癌中起到致癌的作用。miRNA可以调节肿瘤进展中多个基因的表达，并参与调控细胞增殖、转移和凋亡等重要生物学过程[10]。miR-330-3p在不同肿瘤中差异表达，肝癌组织中miR-330-3p低表达，过表达miR-330-3p可通过靶向丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MAP2K1)抑制肿瘤进展[11]。LINC01094通过下调miR-330-3p促进了胶质瘤细胞的增殖和转移[12]。在前列腺癌和三阴性乳腺癌中miR-330-3p还是circ_0016068的靶miRNA，沉默circ_0016068通过上调miR-330-3p表达来抑制肿瘤进展[13]。本研究发现沉默circ_0011385可促进miR-330-3p表达，且沉默circ_0011385与既往研究报道过表达miR-330-3p的抗结直肠癌作用一致[4,5]。进一步分析发现，抑制miR-330-3p表达减弱沉默circ_0011385对SW1116细胞凋亡、迁移侵袭的作用，这表明circ_0011385通过靶向miR-330-3p调控结肠癌进展。

总之，结肠癌中circ_0011385表达上调，沉默circ_0011385通过上调miR-330-3p表达可促进结肠癌细胞凋亡，并抑制迁移和侵袭。因此，circ_0011385和miR-330-3p可能是结肠癌治疗的潜在靶点。