基于新型铁基MOFs负载青蒿素的纳米载药体系构建及抗肿瘤活性研究

李文清，毕军霞，唐诗雨，李亚巍

(吉林医药学院，吉林 吉林 132013)

青蒿素是从天然植物黄花蒿中提取分离得到的一种倍半萜内酯类化合物[1]，具有非常广泛的药理活性，除了抗疟之外，在抗肿瘤方面也具有非常独特的优势，已成为国内外的研究热点[2-3]。然而，这类药物在临床应用中仍存在很多问题，如水溶性差、生物利用度低、非特异性细胞毒性、半衰期短等[4-5]。因此，通过合理设计，构建一种基于新型纳米载体高效递送青蒿素的纳米载药体系，利用其简单、稳定、可控等特点有效解决青蒿素应用过程中存在的问题，实现减毒增效，对于其临床应用具有重要意义。

金属有机框架材料(metal-organic frameworks，MOFs)是一种近些年备受关注的新兴多孔杂化材料，由金属离子与有机配体连接而成。同传统的纳米材料比较，该材料具有配位结构新颖、拓扑结构多变、孔径可调、比表面积大等许多优良特性，目前已被多个领域广泛应用，如催化、传感、气体吸附、药物递送等[6-7]。MIL-100(Fe)(materials of institute lavoisier-100)是由Fe3+与有机配体组装而成的一种具有正四面体结构的新型MOFs材料，这种材料具备良好的生物相容性、稳定性以及灵敏的pH响应性，可以实现新型纳米递药体系对于载药量、稳定性及可控药物释放等多方面的要求[8-10]。

因此，本研究选择MIL-100(Fe)作为青蒿素的载体材料，制备青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒，不仅能够有效降低药物自身的非特异性毒副作用，减少对机体正常组织的影响，同时在进入体内后还能够利用其高通透性和滞留效应被动靶向至肿瘤部位，增加药物在靶点部位的蓄积，并发挥MIL-100(Fe)材料pH敏感的特性，在肿瘤组织弱酸性的细胞环境中发生崩解，有效释放负载药物青蒿素，真正实现药物在靶点部位的高效、精准、可控释放。

1 材料与方法

1.1 实验材料

六水合三氯化铁(FeCl3·6H2O)、均苯三甲酸(BTC)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，青蒿素(美国Sigma公司)，硝酸(HNO3)、氟化钾(KF)(国药集团化学试剂有限公司)，BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；透射电子显微镜(日本电子株式会社)，粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)，Muse全能细胞分析仪(默克密理博公司)，Imark全自动酶标仪(美国BIO-RAD公司)，CKX41-A32PH倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)。

人肝癌细胞HepG2(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由吉林医药学院药学院实验室保存)。HepG2细胞培养于含10%小牛血清(100 U/mL青霉素和100 μg链霉素)的DMEM高糖培养液中，于37 ℃，5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞密度达到80%左右时，0.25%胰酶消化传代。

1.2 MIL-100(Fe)的合成

将FeCl3·6H2O(3 mmol)、BTC(2 mmol)、HNO3(3 mmol)和KF(3 mmol)一同溶于20 mL水中，搅拌均匀，转移至高压釜中，加热反应(120 ℃)24 h，反应结束后分别用蒸馏水及乙醇清洗，以除去未反应的试剂，得黄色MIL-100(Fe)。

1.3 青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒的合成

称取5.0 mg MIL-100(Fe)样品，加入到一定量的青蒿素无水乙醇溶液中，二者质量比为5∶1，室温下搅拌反应3 d，离心干燥后得到青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒。收集上清液用于测定药物的负载量。通过与NaOH(0.2%)在50 ℃下孵育30 min，可以将青蒿素转化为紫外吸收化合物，并检测290 nm处的特征紫外吸收光谱。计算载药量。

1.4 青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对细胞增殖活性的影响

取对数生长期的HepG2细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞浓度至1×104个/mL接种96孔板中，每孔200 μL。待细胞贴壁后，给药组分别给予不同浓度的青蒿素及青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒，每组设5复孔，继续置于培养箱中培养48 h。每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h。弃掉孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡摇匀，在酶标仪上以波长490 nm测各孔的吸光度A490。计算细胞增殖抑制率。

1.5 青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对细胞凋亡影响

收集青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒作用48 h后的HepG2细胞，PBS清洗2次，加入100 μL MuseTM Annexin V&Dead Cell，避光染色20 min，Muse全能细胞分析仪分析细胞凋亡变化。

2 结 果

2.1 青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒表征结果

透射电镜结果(图1)显示，青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒形貌规则，分散性好，粒径比较均匀，单分散纳米粒粒径尺寸约为100 nm；纳米粒的粒径及粒径分布由粒度仪通过测定动态光散射得到，结果(图2)显示，本研究所得纳米粒的平均粒径尺寸为107.9 nm，粒径分布范围为60～160 nm，呈正态分布，与透射电镜测定结果基本一致。证明本实验已成功制得纳米尺寸、形貌均一的青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒。

图 1.青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒的透射电镜图片 图 2.青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒的粒径分布

2.2 青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对HepG2细胞增殖的抑制作用

MTT结果(图3)显示，单独的青蒿素和装载等量青蒿素的青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对于肿瘤HepG2细胞的增殖均具有明显的抑制效果，而且随着两种药物给药浓度的提高，HepG2细胞的存活率均呈现出下降的趋势，说明这两种药物对于肿瘤细胞增殖的抑制作用具有一定的剂量依赖性。另外在同样的青蒿素浓度下，青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对肿瘤细胞增殖的抑制作用明显优于单独的青蒿素，这表明将青蒿素载入MOFs框架结构内制成纳米药物可以有效增强青蒿素小分子药物的体外抗肿瘤效果。这种增强的细胞毒性主要是由肿瘤细胞对于纳米粒子的有效内吞所引起的。

图 3 不同浓度的青蒿素和青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对HepG2细胞增殖的抑制作用

2.3 青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对HepG2细胞凋亡的影响

利用流式细胞仪采用Annexin V-FITC/PI染色法检测了青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒诱导HepG2细胞发生凋亡的情况。结果(图4)显示，对照组细胞早期凋亡率为3.12%，然而经过不同浓度的青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒处理后，肿瘤细胞的凋亡比例显著提升，并且随着给药浓度的增加，细胞凋亡率也表现出升高趋势。20、40和60 μmol/L的青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒给药组的早期凋亡率分别为13.1%、25.36%和30.06%，说明青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒可以诱导肿瘤细胞发生凋亡，且诱导凋亡行为呈剂量依赖性。

图 4 不同浓度青蒿素@MIL-100(Fe)纳米粒对HepG2细胞凋亡的影响

3 讨 论

纳米技术在肿瘤诊断和治疗中的应用为延长患者的寿命和提高其生活质量带来了新的希望，成为未来医学发展最重要的指向。MIL-100(Fe)是由Fe3+与有机配体组装而成的一种具有正四面体结构的新型金属-有机框架材料[11-12]，具有良好的生物相容性、稳定性以及灵敏的pH响应性。MIL-100(Fe)在中性生理条件下结构比较稳定，能够保证对药物的有效包封，避免因药物提前释放而对机体造成损伤；而在弱酸性的环境中，结构中的配位键就会发生解离，材料发生分解，同时释放出负载药物和Fe离子。这样既能够实现负载药物在肿瘤部位的精准、可控释放，同时外源性铁离子的引入还能够有效解决治疗过程中内源性Fe不足的问题，极大的加强青蒿素对癌细胞的杀伤作用[13]。

本研究创造性地利用新型MOFs材料MIL-100(Fe)作为青蒿素的载体材料，构建纳米载药体系，成功合成MIL-100(Fe)，并载入青蒿素，得到稳定性好、形貌规则、尺寸均一的载药纳米粒。体外抗肿瘤研究结果显示，与游离青蒿素相比，装载等量青蒿素的纳米粒对于HepG2肿瘤细胞的增殖具有更强的抑制作用，并且能够诱导肿瘤细胞发生凋亡，说明将青蒿素载入MIL-100(Fe)框架结构内制成纳米药物能够有效增强其体外抗肿瘤活性。

本研究将为青蒿素类药物的抗肿瘤应用提供新的思路和发展方向，也将有助于青蒿素寻找到临床上治疗肿瘤的新突破口。