清肺汤对急性呼吸窘迫综合征大鼠肺损伤及炎性因子的作用研究*

王 丛 张璐瑶 侯海慧 唐艳芬△

（1.江苏省南通市中医院，南京中医药大学南通附属医院，江苏 南通 226000；2.南京中医药大学，江苏 南京 210000）

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的首次提出是在50多年前，其特点是炎性肺损伤导致的肺实质硬化和实变、肺血管通透性改变、肺水含量增加，出现气体交换障碍、血氧饱和度降低［1］。据不完全统计，每年有超过300万人受ARDS影响，占全球ICU住院人数的10%，尽管一直对ARDS的发病机制、治疗手段进行大量研究，其病死率仍较高［2-3］。随着中医药的发展，运用中药治疗急危重症已经得到医学界的认可，尤其是阻断轻症向重症转化的过程［4-5］。清肺汤具有清热解毒、化痰宣肺平喘的功效，本实验在前期研究基础上，提出清肺汤通过减轻急性呼吸窘迫综合征大鼠炎症释放及肺组织水肿的假设，并运用现代检测手段进行验证，明确清肺汤治疗急性呼吸窘迫综合征的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠50只，体质量180～220 g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供，许可证号：SCXK（黑）2019-001，实验室温度（25±2）℃，湿度45%～55%，通风、光照良好，给予清洁的饲料和水，大鼠自由进食，适应性喂养1周后，开始建立急性呼吸窘迫综合征模型。动物伦理批准号：S20210224-064。

1.2 实验药物 清肺汤：金荞麦30 g，鱼腥草30 g，黄芩20 g，葶苈子20 g，熟大黄12 g，麻黄6 g。均为江阴天江药业有限公司的中药配方颗粒，实验前2 h由南通市中医院制剂室配置成实验所需生药浓度，4℃冰箱保存待用。每组用药按照人与大鼠用药换算公式计算剂量。

1.3 仪器与试剂 本实验中所用手术器械购自上海医疗器械有限公司；AF-800电子精密天平购自上海精密公司天平仪器厂；实验冰箱，海尔公司（青岛）；WD-9405B水平摇床、DYY-7C电泳仪、DYCZ-40D转移槽，北京六一生物科技有限公司；JB-P5包埋机、JB-L5冻台，武汉俊杰电子有限公司；P70D20TL-P4微波炉格兰仕微波炉电器有限公司；RM2016病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；Allegra X-30系列离心机，美国Beckman公司，RM2235石蜡切片机，德国Leica公司；BX53显微镜、DP73显微镜拍照系统，日本OLUMPUS公司；脂多糖（LPS）购自上海源叶公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）、ELISA试剂盒均购自Biotopped公司；HE染色试剂盒Biosharp公司。

1.4 模型制备 将50只SD大鼠造模前禁食不禁水12 h后，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，无睫毛反射后将大鼠头高脚低仰卧固定于操作台，操作台与水平面呈45°，将气管插管插入声门内，除去空白组10只，其余大鼠气管内滴注3 mg/kg LPS 100 μL，而后翻转大鼠，使药液均匀分布于大鼠两肺内，约留置6 h，构建ARDS大鼠模型，空白组10只给予同体积的生理盐水作为对照。如果大鼠出现精神萎靡、少动、食欲缺乏、呼吸急促、腹泻等症状，说明造模成功［6］。

1.5 分组与给药 模型建立成功后，将成模大鼠随机分为4组，每组10只。空白组灌胃10 mL/kg蒸馏水，模型组予灌胃10 mL/kg蒸馏水，清肺汤高剂量组按20 g生药/kg中药液+10 mL/kg蒸馏水灌胃，清肺汤中剂量组按10 g生药/kg+10 mL/kg蒸馏水灌胃、清肺汤低剂量组按5 g生药/kg+10 mL/kg蒸馏水灌胃。各组早、晚各给药1次，连续3 d。

1.6 标本采集与检测 治疗结束后各组随机选取6只大鼠，按照0.4 mL/100 g体质量用10%水合氯醛腹腔麻醉，无睫毛反射后将大鼠仰卧操作台，固定门齿及四肢，胸腹部消毒备皮，沿腹部正中线切开约3 cm切口，找到腹主动脉，采集血液，室温静置30 min后3 500 r/min离心15 min，-80℃保存备用。剥离肺组织，冲洗后取部分组织固定于4%多聚甲醛固定液中，4℃保存。1）CRP和PCT含量。按照试剂盒说明书要求，采用ELISA法检测检测大鼠血浆中CRP、PCT含量。2）肺组织中炎性因子表达。ELISA试剂盒要求经设置标准孔和样品孔、加样、加酶、温育、配液及洗涤、显色、终止反应、打开酶标仪450 nm波长处检测肺组织中IL-6、IL-10和TNF-α的含量。3）肺组织病理观察。将右下肺组织经脱蜡、染色、脱水等制成石蜡切片，HE染色后镜下观察。4）肺水肿。右肺上叶用PBS充分洗净，吸去多余水分，天平称取标记湿重（W），将标本放入恒温烤箱中90℃烘烤干燥24 h，称重记录干重（D），计算肺组织湿干重比（W/D）［7］，W/D=（湿重-干重）/干重×100%。

1.7 统计学处理 应用SPSS23.0软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组内比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01具有极显著性差异。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况观察 空白组大鼠造模前后无明显变化，气管滴注脂多糖后模型组大鼠活动减少、精神萎靡、反应较迟钝、呼吸加快、摄食量减少、毛发暗淡，出现打喷嚏等情况，连续灌胃给予高、中、低剂量的清肺汤后症状明显减轻、活动、精神、对外界刺激反应、摄食量均有不同程度好转。

2.2 各组大鼠肺组织病理学变化 见图1。空白组大鼠肺组织中气道腔上皮完整，管腔干净，肺间质及肺泡腔未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠肺组织中气道腔可见分泌物，大范围的肺泡间隔轻中度增厚，肺泡腔狭窄，上皮细胞增生，可见炎性细胞浸润。清肺汤高、中、低剂量组大鼠肺组织中肺泡间隔增厚减轻，肺泡腔狭窄改善，上皮细胞增生减轻，可见少量炎性细胞浸润，清肺汤高剂量组治疗效果最显著。

2.3 各组大鼠血浆CRP、PCT含量及肺组织W/D比较 见表1。与空白组比较，模型组大鼠血浆中CRP和PCT含量明显升高、肺W/D质量比明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，清肺汤高、中、低剂量组中大鼠血浆中CRP和PCT含量明显降低、大鼠肺W/D质量比明显降低（P＜0.05）；与清肺汤高剂量组比较，清肺汤中、低剂量组CRP和PCT含量及肺组织W/D质量比均明显升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血浆CRP、PCT含量及肺组织W/D比较（±s）

表1 各组大鼠血浆CRP、PCT含量及肺组织W/D比较（±s）

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与清肺汤高剂量组比较，△P＜0.05。下同。

组别空白组模型组高剂量组中剂量组低剂量组n6 6 6 6 6 CRP（μg/mL）3.69±0.46 8.95±0.43#4.69±0.62*5.89±0.78*△7.19±0.53*△PCT（ng/L）488.88±41.92 951.18±78.59#641.83±33.248*734.89±44.14*△824.00±51.00*△肺组织W/D 2.97±0.36 6.46±0.41#4.39±0.25*4.95±0.48*△5.72±0.40*△

2.4 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6和IL-10含量比较 见表2。与空白组比较，模型组中大鼠肺组织中TNF-α、IL-6和IL-10含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，清肺汤高、中、低剂量组中大鼠肺组织中TNF-α、IL-6和IL-10含量明显降低（P＜0.05）；与清肺汤高剂量组比较，清肺汤中、低剂量组TNF-α、IL-6和IL-10含量明显升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6和IL-10含量比较（ng/L，±s）

表2 各组大鼠肺组织TNF-α、IL-6和IL-10含量比较（ng/L，±s）

组 别n IL-6IL-10TNF-α 6 6 6 6 6空白组模型组高剂量组中剂量组低剂量组40.68±2.59 107.28±9.67#49.98±5.13*70.20±4.73*△89.30±9.14*△78.55±9.38 171.99±17.99#84.59±7.05*112.94±13.78*△143.55±12.28*△73.47±6.98 188.26±21.18#88.18±6.90*111.42±18.18*△154.08±20.42*△

3 讨 论

ARDS是由心源性以外的肺内、肺外因素所致的急性、进行性呼吸衰竭。主要表现是呼吸窘迫和顽固性低氧血症，肺部影像学表现为非均一性的渗出性病变［8-10］。本病归属于中医学“喘证”“喘脱”“暴喘”范畴，多为本虚标实，虚实夹杂之证，病初为标实属热毒袭肺、痰热壅肺；久病则本虚属气阴两伤、心肾阳虚，本病病位在肺，发生发展与肾、心密切相关［11］。其发病机制复杂、病死率高、治疗周期长，虽然随着医学发展呼吸支持治疗手段在不断进步，但病死率仍居高不下。近年来，中医药治疗ARDS的临床及实验研究取得长足进步，除传统辨证治疗外，基本方随症加减、专方专药的研究也为ARDS的治疗提供了思路。

本实验中所用的清肺汤是南通市中医院肺病科协定处方，结合ARDS中医病因病机特点选用金荞麦、鱼腥草、黄芩、葶苈子、熟大黄、麻黄组成。清肺汤应用于临床近20年，其主要作用为清热解毒、化痰宣肺平喘；方中金荞麦、鱼腥草为君，君臣相须为用共同清肺化痰、排脓消痈；黄芩、葶苈子为臣，黄芩协君药清肺热、解毒抗炎，葶苈子宣肺化痰、止咳平喘；大黄为使药，通腑泻热解毒；麻黄温肺平喘，佐君臣药效同时又可反佐其他药物寒凉之性［12-13］。清肺汤通过多靶点、多途径、多机制发挥作用，对于综合调控复杂的炎症反应更具优势与特色，阻止病情进一步发展。

在前期研究中发现清肺汤能减轻ARDS患者呼出气冷凝液中炎性因子释放［14-15］。本实验以清肺汤高、中、低3种剂量干预ARDS大鼠，通过各组大鼠间比较阐述清肺汤对ARDS大鼠作用机制。通过一般状态观察，大鼠造模后出现少动、呼吸急促、毛色暗淡等情况；与空白组比较，模型组W/D、CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-10均升高，说明造模后急性呼吸窘迫综合征大鼠出现炎症反应、出现肺组织水肿；与模型组比较，清肺汤高、中、低剂量组W/D、CRP、PCT、TNF-α、IL-6、IL-10均下降，说明经过清肺汤治疗后大鼠炎症不同程度减轻、肺水肿减轻；与清肺汤高剂量组比较，各项观察指标均优于中、低剂量组，说明清肺汤治疗效果与用药浓度有关；HE染色可见清肺汤治疗后各组大鼠与模型组比较肺组织炎性渗出明显减轻，清肺汤高剂量组好转最显著。本实验说明清肺汤可能是通过减轻急性呼吸窘迫综合征大鼠炎性介质释放从而减轻肺损伤。