基于网络药理学探究大黄治疗脑水肿作用机制*

薄 晗 赵晓平 范小璇 于 娟 张梦洁 孙 雯

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000）

脑水肿是颅内压增高的主要原因之一，所以控制脑水肿的发生和发展是降低颅内压的关键之一［1］。目前临床多应用甘露醇等高渗脱水剂治疗脑水肿，但会影响电解质水平及肝肾功能［2］。轻型脑水肿患者日常生活中缺乏相应的监测及处置手段，缺乏安全有效的居家保守治疗手段，在院治疗会带来沉重的经济负担，因此探索轻型脑水肿居家治疗手段可以带来明显的社会及经济效益，具有深入探索的意义和价值。随着中医药对脑水肿病因病机及治疗方法的不断探索，其在轻型脑水肿的居家治疗具有一定的实用价值。

大黄是唐古特大黄、蓼科植物掌叶大黄的干燥根和根茎，主产于四川，性味苦寒，归脾、胃、大肠、肝、心包经，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒等功效［3］。本课题组前期通过数据挖掘分析中医药治疗脑水肿的用药规律，可知大黄被广泛应用于脑水肿治疗中，因此探索大黄治疗脑水肿可能存在的作用机制及通路，为临床更好地应用中医药治疗脑水肿提供启迪。

1 资料与方法

1.1 大黄活性成分及作用靶点筛选 在TCMSP平台（http：//tcmspnw.com/）中检索大黄活性成分并按照OB%≥30%进行筛选，对筛选得到的大黄活性成分通过DrugBank数据库（https：//go.drugbank.com/）进行检索匹配，得到大黄活性成分及作用靶点信息。运用Uniprot数据库信息（https：//www.uniprot.org/）对作用靶点蛋白进行筛选及统一命名，去除未能与Uniprot数据库匹配的靶点蛋白。

1.2 大黄成分-靶点网络构建 将筛选得到的大黄活性成分以首字母加数字的形式进行编码，并与活性成分靶点基因相互组合导入Cytoscape3.8.2软件中构建成分-靶点网络，根据自由度值（Dregree）进行网络特征分析，通过节点面积直接反映Dregree值，间接反映该成分重要性。

1.3 脑水肿疾病靶点获取 在TTD数据库（https：//www.db.idrblab.org/ttd/）及 GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）以“cerebral edema”为关键词进行检索，得到脑水肿的疾病相关靶点。通过Uniprot数据库与筛选得到的疾病靶点相匹配，并将疾病靶点蛋白转化为标准基因名，建立疾病靶点基因集备用。

1.4 关键靶点筛选及蛋白相互作用网络构建 运用微生信在线制图平台（https：//www.bioinfor-matics.com.cn/）构建大黄活性成分作用靶点与脑水肿疾病靶点veen图，得到基因靶点公共交集，作为大黄治疗脑水肿的潜在核心基因。删除交集基因重复项后导入Cytoscape3.8.2中，运用Bisogent插件进行蛋白相互作用分析，并根据Betweenness值、Closeness值及Degree值进行筛选，如图1，最终得到存在28个蛋白节点及215条互相作用链接的蛋白相互作用网络（PPI）。

图1 核心靶点筛选及PPI网络制作流程

1.5 关键靶点基因功能注释及通路富集分析 运用Metascape平台（https：//metascape.org）对交集基因分别进行 GO BP（Biological Processes）、GO CC（Cellular Components）、GO MF（Molecular Functions）及 KEGG 富集通路分析，并根据P值及Count值进行筛选，得到大黄治疗脑水肿的生物过程和信号通路。应用Cytoscape3.8.2构建大黄成分-靶点-信号通路网络，将大黄成分、脑水肿疾病靶点及基因信号通路的重要性更加数据化，从而得出大黄治疗脑水肿的核心靶点及主要信号通路。具体流程见图2。

图2 大黄治疗脑水肿网络药理学流程图

2 结 果

2.1 大黄活性成分及靶点基因 运用TCMSP数据库以OB%≥30%为条件得到30种大黄活性成分，并将其导入Drugbank数据库匹配靶点蛋白，去除未能匹配成功的活性成分共8项。对筛选得到的大黄活性成分以首字母加数字形式进行编码，得到大黄活性成分靶点数据表，如表1。通过Uniprot数据库对靶点蛋白转化并为标准基因。将大黄成分及靶点基因导入Cytoscape3.8.2绘制大黄成分-靶点网络图，如图3，外圈表示大黄活性成分，内圈表示活性成分作用靶点基因，并根据Degree值对网络图中节点进行可视化表达。得到大黄活性成分中DLA、beta-sitosterol、aloe-emodin、EUPATIN等成分连接较多的靶点蛋白基因，与PTGS2、PYGS1、HASP90AA1等潜在靶点相互作用较为密切，为进一步研究大黄治疗脑水肿的作用机制提供了参考。

图3 大黄活性成分-靶点网络图

表1 大黄活性成分信息表

2.2 脑水肿疾病靶点预测 在GeneCards及TTD中以“cerebral edema”为关键词进行检索，得到脑水肿的疾病相关靶点。将两种数据库中检索得到的脑水肿的疾病靶点进行合并，删去重复项，共得到脑水肿的疾病靶点共1 691项。

2.3 大黄靶点基因与脑水肿疾病靶点匹配 通过大黄活性成分靶点基因与脑水肿疾病靶点基因相匹配得到45个共同靶点，作为揭示大黄治疗脑水肿的潜在基因靶点。

2.4 PPI构建及拓扑分析 将共同靶点导入Cytoscape并通过Bisogent插件对共同靶点进行分析，共得到4 598个节点，117 471条节点间相互关联网络。对PPI网络数据根据Betweenness值、Closeness值及Degree值进行筛选，最终得到28个核心节点，215条节点间连线，如图4。关键基因靶点包含HSP90AA1、APP、ESR1、CUL3、HSP90AB1、XPO1、EGFR、MCM2、MYC、UBC等。并进一步利用MCODE插件筛选关键基因子板块，其中包括23个节点，70条节点间连线，见表2。

图4 蛋白相互作用PPI网络

表2 MCODE网络拓扑分析结果

2.5 GO分析与KEGG通路分析 将共同靶点导入Metascape平台进行GO分析与KEGG通路分析。分析结果显示大黄治疗脑水肿核心靶点基因主要涉及神经递质的代谢过程、对有毒物质产生反应、调节神经元凋亡和对细胞增殖的负调节等生物过程；影响细胞膜、胞质囊腔、线粒体膜、核质等细胞结构，以及影响蛋白质结构域特异性结合、半胱氨酸型内肽酶活性、参与凋亡信号通路、肿瘤坏死因子受体超家族结合等分子功能，见图5。KEGG结果涉及癌症蛋白多糖通路、雌激素信号通路、乙肝病毒信号通路等，见图6。根据富集分数筛选前10条KEGG通路及其相关基因信息，见表3。

表3 前10条KEGG通路分析表

图5 大黄治疗脑水肿核心靶点GO分析

图6 大黄治疗脑水肿潜在核心靶点KEGG分析

3 讨 论

脑水肿属于中医学中风范畴，张仲景在《金匮要略》中提出“血不利则为水”［4］，道出了颅脑血运不利，旁溢为水而发为脑水肿的病机。明代医家王肯堂在《证治准绳》中提出了“瘀于脑府”“瘀则成水”理论。国医大师张学文教授提出脑水肿多为“颅脑水瘀”证，认为气血运行不畅，导致瘀血内留，水津内生，水瘀互结于颅内而致脑失所养，神机不运，变证从生［5］。中医治疗脑水肿多运用活血化瘀、利水渗湿、凉血通瘀、活血通络等多种治法均取得较好的疗效。

通过综合分析大黄主要活性成分与脑水肿疾病靶点发现没食子酸、乳酸、大黄酸、β-谷甾醇、芦荟大黄素为较为关键的化合物成分。没食子酸可扩张血管和抑制血小板聚集，同时具有抗氧化作用，可通过生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应时提供电子产生清除自由基的作用，从而减轻脑组织的脂质过氧化反应，抑制脑水肿的形成［6］。大黄酸是大黄主要活性成分，具有抑菌、抗炎及调节免疫系统等作用［7］。现代药理学研究发现大黄酸可以逆转AQP4的过度表达，并能够通过抑制氧化应激反应从而阻碍炎症级联反应，从而抑制神经炎症，机制可能与Nrf2/Src/MAPKs通路相关［8］。β-谷甾醇具有抗炎、抗肿瘤及免疫调节等方面的作用，其改善脑组织含水量，降低脑水肿程度机制可能与提高抗炎因子IL-10活性、抑制核转录因子-κB（NF-κB）、增加Th-1型淋巴细胞及改变细胞膜的流行性等方面相关［9-11］。

根据PPI网络结果显示，大黄治疗脑水肿的核心靶点主要有：HSP90AA1、APP、ESR1、EGFR、CUL3、HSP90AB1、XPO1、MCM2、MYC、UBC、FN1、COPS5、CDK2、GRB2等。HSP90AA1广泛分布于脑、脊髓、神经元等组织中，参与细胞周期控制和信号传导。研究发现HSP90AA1抑制下游凋亡蛋白Caspase-9的表达，促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达，增加一氧化氮合成酶生成从而发挥抗凋亡作用，减轻脑缺血钴灌注损伤，减轻脑水肿程度［12］。APP是一种集中分布于神经元突触的膜内在蛋白，可以被α-、β-、γ-蛋白酶分解产生Aβ从而导致脑内老年斑形成和神经细胞凋亡［13］。Bugiani O等发现抑制APP表达可减少脑出血等脑水肿原发疾病发生率［14］。ESR1可影响细胞增殖与分化，减少NF-kappa-B DNA结合活性，是一种配体激活的转录因子，抑制组织炎症反应，降低水肿发生率［15］。EGFR是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，与血管生成、肿瘤细胞侵袭转移和细胞凋亡有关。研究发现EGFR可抑制肿瘤细胞增殖，加速胶质瘤细胞凋亡从而减轻瘤周水肿，降低脑水肿程度［16］。综上，大黄可能通过调节多种核心蛋白表达从而达到治疗或减轻脑水肿的目的。

通过对大黄活性成分靶点与脑水肿疾病靶点共同基因进行GO分析发现，共同基因靶点的生物进程富集主要涉及皮质类固醇反应、神经递质代谢、神经元凋亡进程调控和抗氧化等方面；细胞结构主要涉及线粒体包膜、突触后膜、细胞质囊泡腔、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物等；分子功能富集主要涉及半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡信号通路、肿瘤坏死因子受体超家族结合、钙调蛋白结合、热休克蛋白结合、蛋白质结构域特异性结合等方面。脑水肿是脑组织受损后产生的主要病理变化，其机制主要涉及脂质过氧化反应增强导致的氧自由基损伤血脑屏障后出现的神经细胞损害；炎症因子、肿瘤坏死因子等损伤脑血管［17］。对共同靶点基因的功能富集分析中得到的诸多通路均直接或间接参与脑组织损伤后脑水肿形成过程，提示大黄治疗脑水肿可能通过多靶点共同作用实现。对共同基因靶点的KEGG通路富集进行分析后得出：大黄治疗脑水肿的关键通路主要涉及肿瘤中的蛋白多糖通路、雌激素信号通路等。蛋白多糖通路主要涉及脑组织细胞缺血缺氧后损伤机制，其抗体可减少炎性细胞对脑组织浸润，其进程与GM-CSF及ERK2的表达存在联系［18］。雌激素信号通路主要通过拮抗兴奋性氨基酸而起到保护脑神经的作用。Chen等发现雌激素分泌增加可降低脑出血后组织亚铁含量，增强脑组织中硫氧还蛋白（Trx）活性从而减轻出血后对脑组织产生的损伤，减轻脑水肿程度［19］。Behl等发现雌激素分泌可拮抗神经细胞氧化，机制可能与降低谷氨酸盐、过氧化氢等对海马细胞的毒性作用相关［20］。基于对共同靶点的通路分析得出大黄治疗或减轻脑水肿可能是通过多种途径综合实现，但具体的信号通路在治疗过程中发挥的作用还有待进一步的验证。