小儿止哮平喘颗粒改善幼龄哮喘豚鼠小气道功能受限和气道重塑的实验研究*

陈 恂 彭征屏 冀晓华

（中国中医科学院西苑医院，北京 100091）

儿童哮喘是儿童期最常见的慢性呼吸系统疾病，是增加儿童急诊及住院次数的重要原因，极大地加重了经济和社会负担［1］。新近流行病学调查显示，我国20岁及以上人群哮喘患病率达4.2%［2］，增长率加快［3-4］。儿童哮喘如若控制不良将严重影响患儿日后的生长发育，并造成不可逆的肺功能受损，甚至死亡［5-6］，因此早期诊断、早期干预和规范化管理是提高儿童哮喘控制水平和改善预后的重要手段［4］。气道重塑是儿童哮喘主要的病理改变［7］，是造成不可逆气流受限和持续气道反应的最重要原因，但目前其调控机制尚不清楚［8］。气道高反应是儿童哮喘的主要病理特征，而气道慢性炎症是造成气道高反应的主要原因，研究表明哮喘患儿早期通气肺功能改变并不明显，而此时即可出现小气道功能下降，并与气道高反应性密切相关［9-11］。

小儿止哮平喘颗粒是中国中医科学院西苑医院的院内制剂，长期的临床应用发现其在儿童哮喘的治疗中疗效卓著。本研究拟通过OVA雾化吸入并激发建立幼龄豚鼠哮喘模型，初步探讨小儿止哮平喘颗粒对气道重塑及小气道功能的改善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级幼龄豚鼠50只，3周龄，体质量140～160 g，雌雄各半，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011，均饲养于北SPF级动物房中，室温20～26℃，相对湿度40%～70%，换气次数≥15次/h，维持12 h/12 h昼夜交替光照。实验前适应性饲养7 d，以全价颗粒饲料喂养，自由饮水。实验中对实验动物的处理遵循3R原则。动物福利通过北京盈科瑞药物安全有效性研究有限公司审查（审批号：YKR-2020-003）。

1.2 试药及仪器 小儿止哮平喘颗粒：主要成分为麻黄、杏仁、黄芩、地骨皮、赤芍、丹参、地龙、紫苏子、葶苈子、仙鹤草；院内制剂，京药制备字Z20200066000，批号191201，生药含量4.85g/g，黄棕色颗粒剂。卵白蛋白（OVA）：规格25 g/瓶，购自Sigma公司，批号A5253。小动物肺功能仪（Emka Technologies Inc WBP型）、小动物口鼻暴露系统（北京慧荣和HRH-MNE302型）、自动组织脱水机（Leica HistoCore PEARL）、生物组织包埋机（浙江科迪KD-BM）、包埋机冷冻台（浙江科迪KD-BL）、石蜡切片机（Leica RM2235）、生物组织摊片机（浙江科迪KD-P）、生物组织烘片机（浙江科迪KDH）、电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣DGG-9140A）、自动染片机（SAKURA DRS 2000JC-D2）、光学显微镜（OLYMPUS BX43）。

1.3 分组与造模 幼龄豚鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组，每组10只，雌雄各半。除空白对照组外，其余各组腹腔注射卵白蛋白1 mL致敏。间隔1周，进行第2次致敏。

1.4 给药方法 第2次致敏次日开始灌胃给药，中药高、中、低剂量组剂量分别为17.2、8.6、4.3 g/kg，给药体积均为10 mL/kg。每天1次，连续给药7 d。空白组、模型组予等量生理盐水灌胃。各组均在末次给药后雾化OVA溶液（4 mg/mL）激发40 min。

1.5 观察指标 1）肺功能。各组在OVA激发结束后进行肺功能测定，计算支气管收缩系数（PENH）。2）组织病理学染色。处死豚鼠，取右肺置10%甲醛溶液中固定，脱水，切片。将病理切片行苏木精-伊红（HE）染色，用显微镜观察肺组织病理变化。3）肺组织小气道形态学检测。用Image j图形软件分析测定肺内支气管基底膜周径（Phm）、总管壁面积（Wat）及平滑肌面积（Wam）。用Phm将Wat和Wam标准化，得到Wat/Phm和Wam/Phm的比值，用以比较每组支气管内管壁与平滑肌的厚度的变化［12］。

1.6 统计学处理 采用SPSS21.0软件进行统计分析。定量资料以（±s）表示，采用Komogorov-Smirnov检验（样本量≥5）和Q-Q图分析是否满足正态分布，不满足正态分布的组间比较采用秩和检验，满足正态分布行Levene检验判定方差齐性，方差齐时组间比较采用独立样本t检验，不齐时采用t′检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组幼龄豚鼠肺组织小气道病理形态学改变

空白组镜下可见：肺内小气道上皮完整，连续光滑，无水肿及增厚坏死，管腔规则无狭窄，周围无炎症细胞浸润。模型组镜下可见：肺内小气道上皮脱落，不连续，黏膜水肿，管腔狭窄，可见痰拴，气道管壁及基底层明显增厚，支气管平滑肌细胞明显增生，气道可见大量炎性细胞浸润，包括肥大细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等，与模型组相比，中药各剂量组在炎性细胞浸润、支气管壁增厚及平滑肌增生、气道上皮水肿、管腔狭窄方面都有不同程度的改善，中药高剂量组和空白组几无差异。见图1。

图1 各组豚鼠肺组织小气道病理形态学改变（HE染色）

2.2 各组幼龄豚鼠肺组织小气道形态学指标比较

见表1。Wat/Phm：与空白组相比，模型组显著增厚（P＜0.01）；中药各剂量组较模型组均显著降低（P＜0.01），与空白组相比无明显差异（P＞0.05）。Wam/Phm：与空白组相比，模型组与中药低剂量组显著增厚（P＜0.01）；中药各剂量组较模型组均显著降低（P＜0.01），中药中、高剂量组与空白组相比无明显差异（P＞0.05）。

表1 各组豚鼠Wat/Phm及Wam/Phm比较（±s）

表1 各组豚鼠Wat/Phm及Wam/Phm比较（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001。下同。

组别空白组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 Wat/Phm 45.65±4.47 107.66±15.17**54.66±7.65##44.62±1.11##39.25±3.82##Wam/Phm 22.57±3.60 58.26±2.37***39.70±4.25**##29.77±1.38###21.77±3.19###

2.3 各组幼龄豚鼠肺功能结果比较 见表2。与空白组相比，模型组PENH显著增高（P＜0.01）；中药各剂量组较模型组均有降低，其中，中药高剂量组与模型组相比有统计学差异（P＜0.05）。

表2 各组幼龄豚鼠肺功能PENH比较（±s）

表2 各组幼龄豚鼠肺功能PENH比较（±s）

组别空白组模型组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 PENH 0.40±0.10##3.62±3.14 2.29±3.26 1.75±0.99 1.24±1.26#

3 讨 论

中医学认为哮的病因病机为“本为肺脾肾三脏不足，内有痰瘀伏肺，外有风邪为患”。小儿止哮平喘颗粒为中国中医科学院西苑医院著名儿科专家安效先教授根据“风痰瘀”理论结合多年临床经验组方而成，作为中国中医科学院西苑医院院内制剂长期应用，在治疗儿童哮喘和咳嗽变应性哮喘方面疗效显著。方中麻黄、杏仁一宣一降恢复肺气升降，并予地龙祛内、外之风，黄芩、地骨皮清泻肺火，丹参、赤芍活血化瘀，紫苏子、葶苈子降气豁痰平喘，仙鹤草敛肺补中，诸药合用，共奏宣肺清热、止哮涤痰、化瘀平喘之功。体内研究已证实，小儿止哮平喘颗粒能延长咳嗽、喘憋潜伏期，促进酚红排泌，具有止咳、化痰和平喘作用［13］。

气道重塑是儿童哮喘等慢性炎症性气道疾病的主要病理表现。气道壁厚度的增加限制了气道的灵活性和松弛性，从而影响呼吸。目前，对于气道重塑的潜在调控机制尚不清楚，缺乏有效的预防和治疗手段。气道重塑的病理改变包括气道平滑肌细胞（ASMCs）肥大或增生、黏液高分泌、上皮下纤维化、上皮下基底膜增厚、血管生成和杯状细胞化生［14］。ASMCs在气道炎症和气道重塑等气道病理过程中起着关键作用。ASMCs异常增生，可导致气道壁增厚，促进哮喘患者气道重塑的发生［15］。本研究结果证实，小儿止哮平喘颗粒各剂量组较模型组均能明显降低气道总管壁面积和气道平滑肌面积，中、高剂量组与对照组无明显差异，提示小儿止哮平喘颗粒对于OVA致敏幼龄豚鼠哮喘模型的小气道重塑具有潜在的改善作用。

小气道指的是直径＜2 mm且气管壁不含有软骨，从第8级支气管延伸到末端支气管的气道总称［16］，包括终末细支气管和呼吸性细支气管。哮喘患儿的肺实质及大小气道均存在炎症改变，而无论哮喘程度如何，均存在小气道的炎症，且小气道的炎症能反映哮喘的控制情况［17］。在哮喘患者中，50%通气肺功能检查可处在正常范围［18］，90%以上的哮喘患者存在小气道功能受损［19］，研究证实将小气道功能改善＞30%作为肺功能舒张试验阳性指标则可显著提高儿童哮喘诊断的敏感性［18］。此外，小气道功能受损与儿童哮喘长期持续、急性发作风险、住院率、急诊就诊率、激素使用率和ICU治疗风险等因素显著有关［18，20］。因此，小气道功能评价有助于儿童哮喘的诊断和疗效的评价。本研究结果证实，小儿止哮平喘颗粒不仅能明显降低幼龄豚鼠PENH，还能在小气道炎性细胞浸润、气道上皮水肿、管腔狭窄方面都有不同程度的改善，其中高剂量组和对照组几无明显差异。提示小儿止哮平喘颗粒对于OVA致敏幼龄豚鼠哮喘模型的小气道功能具有潜在的改善作用。

本研究结果初步证实小儿止哮平喘颗粒具有改善儿童哮喘小气道功能障碍和小气道气道重塑的潜在功效，但是评价指标并不全面，存在如下问题：1）没有收集肺泡灌洗液做细胞分类和计数，未能量化评价气道炎症和过敏状态水平；2）本研究使用的是无创型肺功能检查，用PENH反应气道阻力，这种做法尚存争议，之后的实验当使用气管插管状态下的肺功能检查方法，直接测定气道阻力、顺应性评价气道高反应性；3）仅从组织病理学染色评价小气道功能的改善，应当结合肺功能检查结果，综合呼出25%、50%、75%肺活量时的呼气流速结果评价小气道阻塞和气流受限情况。之后的研究中将改进实验方法和检测指标，以期证明小儿止哮平喘颗粒对儿童哮喘小气道功能受限和气道重塑的改善作用，为中医药治疗儿童哮喘提供实验室依据。