N-乙酰神经氨酸的研究现状

赵红宇，李学琳，周盛华，关文凤，景志刚，王春柳

黑龙江康普生物科技有限公司（哈尔滨 150025）

N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）又称为唾液酸，是酸性糖神经氨酸的乙酰化衍生物[1]。化学命名5-氨基-3, 5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖（图1）[2]。

图1 N-乙酰神经氨酸

Neu5Ac广泛存在于哺乳动物组织中，是黏蛋白、糖蛋白和糖脂的低聚糖链的组成部分，占据复杂碳水化合物低聚糖链的末端非还原位置，以各种方式连接在细胞膜内外表面，具有重要的生理功能[3]。人体中中枢神经系统和母乳中Neu5Ac含量较为丰富，母乳中Neu5Ac水平为0.25～1.50 g/L[4]，以与低聚糖结合的形式为主，是富含Neu5Ac的天然食品。除母乳外，Neu5Ac还存在于燕窝、酪蛋白、牛奶和鸡蛋中，燕窝是NeuAc含量最高的天然物质，含有7%～12%的Neu5Ac，约为蛋黄（0.19%）的50倍[5]。

NeuAc在生物识别、细胞免疫和疾病方面具有重要作用，是唾液酸化人乳低聚糖（唾液酸化HMOs或唾液酸乳糖）的最重要单体之一，对改善婴儿发育至关重要[6]。特别是，2017年我国国家卫生健康委员会发布第7号公告，批准Neu5Ac为新食品原料。2016年，美国FDA批准Neu5Ac二水合物可用于普通食品和婴儿食品，2017年，欧盟委员会批准Neu5Ac和Neu5Ac二水合物作为新食品成分使用。

1 N-乙酰神经氨酸的合成与代谢

人体可通过食物摄入和自身合成Neu5Ac。肝脏是Neu5Ac主要的合成器官，在细胞浆内，从葡萄糖开始经过很长的途径产生Neu5Ac（图2）[7]。唾液酸化发生在胞质内，有多种分子参与其中，游离的Neu5Ac残基被活化（磷酸化），以CMP-Neu5Ac形式经由反向转运蛋白泵入高尔基体腔，通过几种合成后修饰，如甲基化、硫酸盐化、乳糖化、乙酰化和内酯化，继而通过唾液酸转移酶连接到糖链上，形成具有不同功能的唾液酸复合物，这一过程被称为“唾液酸化”，形成唾液糖蛋白和唾液糖脂等，如神经节苷脂等[8]。糖链上的Neu5Ac最终由体内或溶酶体中的唾液酸酶移除[9]，再次形成游离的Neu5Ac，从而达到循环利用的目的。

图2 N-乙酰神经氨酸在体内的新陈代谢途径

摄入的Neu5Ac，无论是作为游离Neu5Ac还是唾液酸基低聚糖，很容易在肠道被吸收，并在6 h内进入血液和组织。Neu5Ac摄取到组织后可能会被唾液酸裂解酶裂解，转化为N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸。N-乙酰甘露糖胺随后被用于再合成唾液酸复合物[10]。大鼠肠道细胞壁对游离Neu5Ac具有高度的渗透性。经放射性标记的Neu5Ac和Neu5Ac乳糖被大鼠幼崽吸收良好（约90%），30%留在体内，6 h后3%～4%留在大脑中。

2 N-乙酰神经氨酸的功能

2.1 Neu5Ac与神经系统和大脑发育

关于Neu5Ac及其生物学作用已经有了广泛的研究。Neu5Ac对神经系统的发育和功能至关重要。它参与调节突触发生、神经发生、细胞增殖和迁移、细胞粘附和轴突引导，并调节先天免疫功能[11]，特别是Neu5Ac在学习和记忆中扮演着重要的角色[12]。然而，牛奶中的Neu5Ac含量非常低（8～25 mg/L），远低于母乳中的Neu5Ac含量[13]。通过膳食补充Neu5Ac可以提高大脑中的Neu5Ac含量，以改善学习和记忆。研究表明，在饮食中补充Neu5Ac有利于婴儿骨骼生长、大脑发育和老年人大脑功能的维持[7]，在老年痴呆和精神分裂症患者大脑中的Neu5Ac含量减少，经Neu5Ac药物治疗后，Neu5Ac含量恢复正常，表明Neu5Ac参与了神经组织活动[14]。

2.2 Neu5Ac与生殖和免疫

在人体生殖系统中，Neu5Ac在精子和卵细胞成熟、受精、精子与卵子接触[15]，精子到达卵子之前与雌性生殖道的各种液体和表面的相互作用期间[16]均发挥重要的生理功能。唾液酸化对于保护胎儿的胚外组织免受母体补体攻击至关重要[17]。完全唾液化的糖蛋白和细胞的行为被称为“自我”，它们是完整的，并被生物体耐受。一旦Neu5Ac失去，分子和细胞就变成“非自身”，不再适应正常“行为”所需的化学结构，因此，它们被生物体的防御系统识别，并最终被摧毁[18]。这个防御系统是免疫系统的一部分，因此“自我/非自我”双重系统在免疫学中起着至关重要的作用[19]。许多生物治疗产品（抗体、细胞因子和激素）都是糖蛋白，糖蛋白上的唾液化程度（通常称为“盖帽”）决定产品的利用程度，任何主要成分的低唾液化都会导致分子被快速清除，因此，大多数生物治疗产品都需要进行末端唾液化测试，这也通常是美国食品和药物管理局的要求。

2.3 Neu5Ac与肿瘤

在肿瘤细胞中，Neu5Ac的掩蔽作用也具有重要意义[1]。肿瘤细胞表面被NeuAc高度包被[20]。这种高唾液酸化常导致癌症进展加速，促进免疫逃逸，增强肿瘤增殖和转移，帮助肿瘤血管生成，并帮助抵抗凋亡和癌症的治疗[21]，细胞表面的NeuAc改变，是由唾液酸转移酶引起的，Neu5Ac的尿苷和次黄嘌呤衍生物可以抑制癌细胞转移，因为它是唾液酸转移酶的强抑制剂[22]。

2.4 Neu5Ac与自由基

Neu5Ac的活性羟基可提供活泼氢与超氧阴离子自由基（O2-）、羟自由基（-OH）结合，起抗自由基氧化的作用，只有游离状态的Neu5Ac能起到作用。另外，羟基还可与金属离子络合，减少自由基的产生。体外试验研究表明，燕窝中的Neu5Ac能有效抑制酪氨酸羟基酶的活性，减少多巴色胺的产生，防止黑色素的生成，具有一定的美白成效[23]。

2.5 Neu5Ac的其他功能

Neu5Ac还能增强肠道对矿物质和维生素的吸收，促进骨骼发育。Neu5Ac多肽可防止肠道毒素和致病菌与肠道黏膜细胞结合，从而提高肠道的抗菌、解毒和抗病毒能力[24]。Neu5Ac粘附在红细胞表面，保护红细胞，防止血液循环中细胞不必要的相互作用，Neu5Ac在调节这些血液成分的寿命和维持体内平衡方面是至关重要的。此外，它可以用于治疗类风湿性关节炎，细胞表面的Neu5Ac可以有效地防止白细胞过度聚集，起到抗炎的作用[1,25]。

3 N-乙酰神经氨酸的生产工艺

目前食品工业生产的NeuAc国内和国外工艺明显不同。国内新食品原料批准的生产工艺是以食品级葡萄糖和玉米浆为原料，经大肠埃希氏菌（菌株号SA-8）发酵、过滤、灭菌、水解、提纯等工艺制成的无水Neu5Ac。

3.1 国内Neu5Ac的生产工艺

大肠杆菌发酵合成聚唾液酸，然后将其水解制备Neu5Ac是目前国内批准Neu5Ac生产的唯一方法。自然界中少数几种细菌细胞可以生产聚唾液酸，大肠杆菌是其中的一种，通常选用E.coliK1和E.coliK235，以山梨醇、葡萄糖或木糖为底物生产[26]。用液体培养基培养这些细菌时，聚唾液酸以黏液的形式释放到发酵液中。郭良栋等[27]经过筛选，得到一株高产聚唾液酸菌株E.coliC8，聚唾液酸产量为1.2 g/L。

Zhan等[28]通过控制E.coliK235发酵过程中的pH和补料，聚唾液酸产量为3.5 g/L。刘金龙等[29]通过pH控制并对菌株培养模式进行优化，将聚唾液酸的产量提高至4.8 g/L。Zhang等[30]通过两阶段 pH 控制和补料分批发酵，聚唾液酸的产量提高到5.65 g/L。郭亭等[31]以大肠杆菌突变株GX124为聚唾液酸发酵菌株，不同碳源、氮源以及磷酸盐浓度，发酵48 h，聚唾液酸产量高达15 g/L，同时基于陶瓷膜截留聚唾液酸，建立了一种高效制备聚唾液酸的半连续发酵工艺。在发酵过程中，当聚唾液酸浓度达到一定程度（约8 g/L）时，离心回收菌体，通过陶瓷膜截留聚唾液酸实现产物分离，滤液与菌体混匀继续发酵，重复5个批次，发酵90 h，唾液酸总产量达40.1 g/L。

3.2 国外Neu5Ac的生产工艺

美国批准的Neu5Ac生产是经酶法催化制成的Neu5Ac二水合物，欧盟Neu5Ac采用同样工艺制成Neu5Ac二水合物和无水Neu5Ac，值得一提的是美国和欧盟批准的Neu5Ac均是由全球知名的HMO供应商丹麦Glycom A/S公司申报的，Glycom A/S公司于2020年被荷兰皇家帝斯曼集团收购。Glycom A/S公司生产的Neu5Ac是由N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸钠作为直接前体，采用N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NAL CAS：9027-60-5；E.C.：4.1.3.3）直接催化合成的，经过结晶提取成无水的Neu5Ac，再复溶后经异丙醇重结，过滤烘干后即为Neu5Ac二水合物。

N-乙酰甘露糖胺价格非常高，有学者研究发现可以通过N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶（AGE）异构化N-乙酰葡萄糖胺得到N-乙酰甘露糖胺[32-33]，然而AGE酶不易获得且催化过程复杂，如对ATP有强烈的依赖性和丙酮酸抑制AGE酶活性，限制了Neu5Ac的酶法工业化生产[34]。Klermund等[34]从多变鱼腥藻（ATCC 29413）中鉴定了一个新的AGE酶，其在高底物浓度和不添加ATP的情况下，活性为有ATP时的32%。当使用可溶性酶时，上述两步酶法也存在一些缺点，包括转化率低和反应时间长。为了在两步酶法中使平衡向Neu5Ac方向转变，添加了大量的丙酮酸。同时，开发出固定化酶法，增加酶的使用次数成为研究的重点。Hu等[35]在大肠杆菌中同时表达NAL和AGE，并将它们固定在环氧树脂上，在单个反应器中将N-乙酰氨基葡萄糖胺转化为Neu5Ac，该体系的转化率可达73%以上，反应次数在5次以上。Wang等[36]表达了双标记的AGE和NAL酶融合，通过离子标记在离子交换树脂上固定化，从200 mmol/LN-乙酰氨基葡萄糖胺和100 mmol/L丙酮酸，10 mmol/L ATP和10 mmol/L MgCl2中获得了135 mmol/L Neu5Ac。Bloemendal等[37]设计了高效连续流反应器，用Immobead 150P固定载体固体NAL酶。连续流反应器中NAL酶活性与天然酶相比没有降低，在丙酮酸（100 mmol/L）、N-乙酰氨基甘露糖胺（500 mmol/L）和0.05 mL/min的连续流速下，N-乙酰氨基甘露糖胺的转化率达到82%。总的来说，酶法固定具有反应速度快、反应条件温和易控、底物转化率高、容易获得且价格便宜、固定化酶可反复多次利用、提取方便、产品纯度高等优点。

3.3 Neu5Ac的分离纯化

Neu5Ac的分离纯化方法在不同原料中有所不同。发酵法一般经过除菌、除蛋白、水解、脱色、除盐、结晶等工艺流程，获得高纯度Neu5Ac。发酵液首先经过加热预处理，然后离心去除菌体或直接过陶瓷膜取上清液除菌体，然后通过超滤膜后再过离子交换柱（碱性阴离子交换树脂变为聚唾液酸钠）或直接加乙醇或络合剂去除蛋白再加水复溶，同时起到了浓缩的作用，除蛋白后加热强酸水解或微波水解，Neu5Ac单体经活性炭过滤得到脱色液，再浓缩至溶液中，唾液酸钠的质量浓度为300～500 g/L，浓缩液中加入冰乙酸低温结晶[38]。此种方法加入冰乙酸析出的晶体均为Neu5Ac无水物，同时结晶还可以采用乙酸乙酯等。袁丽霞等[39]通过向Neu5Ac浓缩液中加入酸溶液，调节溶液体系的氢离子浓度，即pH，制备高纯度的Neu5Ac二水合物，采用离心过滤或者板框过滤的方式得到结晶，经冷冻干燥、真空干燥或者微波干燥，得到Neu5Ac成品。

酶法生产的Neu5Ac提取相对简单，转化液直接脱色浓缩后结晶，结晶过滤烘干后得到成品。朱薇薇[40]采用500 Da超滤膜的方式去除丙酮酸钠，再用离子树脂吸附去除N-乙酰葡萄糖胺，最后得到较为纯净的Neu5Ac转化液，直接利用异丙醇结晶，即可得到高纯度（纯度≥99.5%）的二水合物，丙酮酸钠和N-乙酰葡萄糖胺再次进入转化循环利用。

4 结语与展望

目前食品工业生产获批的聚唾液酸发酵法和酶催化合成，聚唾液酸水解生成Neu5Ac，其产率低，不足以满足工业化生产的需要，酶催化法底物价格昂贵[41]，使得Neu5Ac价格居高不下，限制了Neu5Ac在食品、化妆品及医药领域的应用。随着代谢工程和蛋白质工程的发展，聚唾液酸发酵生产Neu5Ac工艺不断改进，Neu5Ac产量不断提高。研究学者还开发出了全细胞催化法和微生物直接生产法。全细胞生产法与酶催化法相比不需要辅酶[42]，但在全细胞催化过程中，底物和产物的转移通常受到细胞膜的抑制，通过基因工程手段可以提高细胞膜的通透性[43]，从而提高全细胞催化过程中的反应速率和产物收率[44]。通过微生物发酵重头合成Neu5Ac可以利用葡萄糖或甘油等来满足工业化规模生产的需求，增强主要代谢途径、突变反馈抑制、消除竞争途径等已被用于提高Neu5Ac的产量[14,45-46]，这很可能成为未来Neu5Ac生产的主要方法。