液相色谱-质谱法分析磷酸芦可替尼中强制降解后的产物

2022-07-04刘发贵孙丽霞李敏刘思光李铁健张贵民山东新时代药业有限公司山东临沂273400鲁南制药集团股份有限公司山东临沂276002

中南药学 2022年4期

刘发贵，孙丽霞，李敏，刘思光，李铁健，张贵民（.山东新时代药业有限公司，山东临沂 273400；2.鲁南制药集团股份有限公司，山东临沂 276002）

骨髓纤维化实质上是一种骨髓增殖性肿瘤[1]。磷酸芦可替尼作为一种 JAK抑制剂[2-3]，具有潜在的抗肿瘤和免疫调节活性，用于治疗中间或高危骨髓纤维化，包括原发性骨髓纤维化，真性红细胞增多症后骨髓纤维化和原发性血小板增多症后骨髓纤维化的治疗[4-5]。磷酸芦可替尼作为首个骨髓纤维化治疗药物（结构见图1），也是目前唯一批准针对其发病机制的靶向药物[6-7]。

图1 磷酸芦可替尼化学结构图Fig 1 Chemical structure of ruxolitinib phosphate

本文主要采用高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）研究磷酸芦可替尼的强制降解产物，了解其稳定性及降解途径[8-10]，为药品的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦UPLC串联6540B Q-TOF色谱-液质联用仪（安捷伦）；高效液相色谱仪Thermo Ultimate 3000，配DAD检测器（Thermo）；高效液相色谱仪Waters ALLIANCE e2695，配PDA检测器（Waters）；电子分析天平（XSR105U/A、XPR10）、pH计（S210）（Mettler Toledo）。

1.2 试药

乙酸铵（Merck，LC-MS专用，50 g，批号：A1468804117）；氢氧化钠（批号：2009172）、盐酸（批号：2103151）、30%过氧化氢（批号：190826）（西陇科学，分析级）；乙腈（Merck，色谱级，批号：I1102930036）；磷酸芦可替尼（佰麦生物，纯度：99.9%，批号：BM20210111）。

2 方法

2.1 液相色谱条件

色谱柱：YMC Triart C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）；以水为流动相A，甲醇为流动相B；梯度洗脱（0～5 min，45%B；5～20 min，45%～70%B；20～25 min，70%～75%B；25～26 min，75%～45%B；26～35 min，45%B）；柱温40℃；流速1.0 mL·min-1；检测波长230 nm，同时开启3D数据采集（190～400 nm）；进样量20 μL。

2.2 色谱-质谱条件[11]

色谱柱：YMC Triart C18（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；以10 mmol·L-1乙酸铵水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；梯度洗脱（0～2 min，20%B；2～14.5 min，20%～60%B；14.5～14.6 min，60%～20%B；14.6～20 min，20%B）；柱温40℃；流速0.3 mL·min-1；检测波长230 nm；进样量10 μL。

电喷雾解吸电离源DESI，正离子检测模式；离子源雾化温度300℃；毛细管电压400 V；锥孔电压45 V；裂解电压60 V（Fragmentor）；干燥气流量8 L·min-1；MS扫描范围50～1600m/z。

2.3 溶液配制

2.3.1 供试品溶液（未破坏溶液）取本品约2 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加乙腈-水（20∶80）（以下简称溶剂）溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液（质量浓度为 0.2 mg·mL-1）。

2.3.2 强制降解试验取本品约2 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，高温破坏24 h（105℃条件下固体直接暴露）；取供试品溶液直接暴露于4500 lx强度光照10 d；氧化破坏（1 mL溶剂溶解后，加10%双氧水1 mL，80℃水浴）2 h；酸破坏（1 mL溶剂溶解后，加2 mol·L-1盐酸溶液1 mL，80℃水浴）2 h；碱破坏（1 mL溶剂溶解后，加1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，80℃水浴）5 min。取上述各破坏样品，加溶剂稀释至刻度（酸碱破坏需中和至中性），摇匀，滤过，取续滤液，作为各条件下的强制降解溶液。同时做各条件下的空白试验。

3 结果

3.1 强制降解结果

经过液质联用的分析，初步鉴定出11个降解杂质，分别命名为杂质A～K，各破坏条件下降解杂质及磷酸芦可替尼含量见表1及图2。

图2 强制降解性试验HPLC色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of the forced degradation

表1 磷酸芦可替尼强制降解试验结果 (%) Tab 1 Ruxolitinib phosphate forced degradation test (%)

3.2 磷酸芦可替尼及降解产物母离子与特征离子

通过ESI＋-MS对上述破坏溶液进行测定，得到磷酸芦可替尼降解杂质一级质谱图的[M＋H]＋及主要特征离子，各降解杂质可能的降解途径及结构推理简要如下。

3.2.1 杂质A、杂质B和杂质C

① 对于杂质A、杂质B：ESI＋-MS测得的杂质A的一级质谱图中m/z325为[M＋H]＋峰，相对分子质量为324，比芦可替尼多一个水分子。最有可能是-CN官能团被氧化，成为酰胺键。ESI＋-MS测得的杂质B的一级质谱图中m/z326为[M＋H]＋峰，表明其相对分子质量为325，比芦可替尼多19，即-CN被氧化成-COOH。最有可能是在杂质A的基础上，-NH2被-OH取代（见图3）。

② 对于杂质C：ESI＋-MS测得的杂质A的一级质谱图中m/z186为[M＋H]＋峰，相对分子质量为185，正好是杂质C的一个单元。从芦可替尼中掉下的另一个五元环单位，紫外响应弱，本法无法有效检出（见图3）。

图3 磷酸芦可替尼降解产生杂质A、B和C的可能途径Fig 3 Possible degradation pathways for impurity A， B and C from ruxolitinib phosphate degradation

3.2.2 杂质D、杂质E和杂质F

① 对于杂质D：ESI＋-MS测得的杂质D的一级质谱图中m/z311为[M＋H]＋峰，相对分子质量为310，比芦可替尼多4。最有可能是结构中含1个氮的五元环发生光自由基反应，从而开环，分别生成-NH2和-CHO，推测出杂质D的结构（见图4）。

② 对于杂质E和杂质F：ESI＋-MS测得的杂质E的一级质谱图中m/z323为[M＋H]＋峰，相对分子质量为322，比芦可替尼多16。可能是芦可替尼C14位和C15位形成环氧环，推测出杂质E。ESI＋-MS测得的杂质F的一级质谱图中m/z341为[M＋H]＋峰，相对分子质量为340，比杂质E多18。即比杂质E的环氧环发生了开环，生成2个-OH，推测出杂质F的结构（见图4）。

图4 磷酸芦可替尼降解产生杂质D、E和F的可能途径Fig 4 Possible degradation pathway for impurity D，E and F from ruxolitinib phosphate

3.2.3 杂质G、杂质H和杂质I

① 对于杂质G：ESI＋-MS测得的杂质G的一级质谱图中m/z305为[M＋H]＋峰，表明其相对分子质量为304，比芦可替尼少2。即最有可能是手性碳原子上形成双键，即6号位和3号位形成双键。推测出杂质G的结构（见图5）。

图5 磷酸芦可替尼降解产生杂质G、H和I的可能途径Fig 5 Possible degradation pathways for impurity G，H and I from ruxolitinib phosphate

② 对于杂质H和杂质I：ESI＋-MS测得杂质H的一级质谱图中m/z373为[M＋H]＋峰，相对分子质量为372，比杂质A多48，可能是7、9、17号位等3个位置的氮形成了氮氧键，推测出杂质H的结构。同理分析，ESI＋-MS测得杂质I的一级质谱图中m/z357为[M＋H]＋峰，相对分子质量为356，比杂质A多32。可能9号和17号位置氮形成氮氧键，但具体位置，目前的研究无法准确判定，需要进一步试验进行确认。

3.2.4 杂质J和杂质K ESI＋-MS测得的一级质谱图中m/z323均为[M＋H]＋峰，相对分子质量均为322，比杂质A少2，可能是手性碳原子位置脱去2个氢形成双键，即3号和6号位置间，6号和16号位置间，具体两者如何区分，目前研究无法确认，有待进一步试验确认，本文将3号和6号位置间形成双键的化合物命名为杂质K，另一结构命名为杂质J（见图6）。

图6 磷酸芦可替尼降解产生杂质J和K的可能途径Fig 6 Possible degradation pathways for impurity J and K from ruxolitinib phosphate

综上将磷酸芦可替尼可能的降解途径归纳见图7。

图7 磷酸芦可替尼可能的降解途径Fig 7 Possible degradation pathways of ruxolitinib phosphate

4 结论

磷酸芦可替尼在高温和光照条件下，较为稳定，但是在酸和碱条件下易降解，氧化条件下极易降解。经过初步鉴定共得到11个降解杂质（见表2及图8），其结构还存在不确定性，本文提到的结构仅供参考[12-13]。杂质H和杂质I均为氮氧化合物，由于结构中存在较多氮原子，在无对照品的基础上，很难确定其准确的氮氧键的位置，本文列出的结构为理论上最大可能性的结构。同时杂质J和杂质K为同分异构体结构，性质类似，目前的研究无法判定其在本法中的出峰顺序，有待进一步试验证明。