基于LC-MS法分析宁夏贺兰山野生酸枣不同部位化学成分

梁雨璐，李忆红，雷艳，刘传鑫，黄建梅*（1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.河南科技大学临床医学院，河南科技大学第一附属医院内分泌代谢中心，河南省遗传罕见病医学重点实验室，国家代谢性疾病临床医学研究中心洛阳分中心，河南 洛阳 471003；3.北京中医药大学中药学院 中药品质评价北京市重点实验室，北京 102488）

酸枣仁（Ziziphi Spinosae Semen）为鼠李科植物酸枣[Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟种子，主产于河北、陕西、山西、辽宁、河南等省，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津的功效，主要用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等证[1]。酸枣仁的主要成分为萜类、黄酮类、脂肪酸、挥发油、生物碱、多糖以及一系列吲哚衍生物等[2]，其中皂苷类、黄酮类成分具有镇静安眠的作用。另外酸枣仁还具有抗惊厥、抗抑郁、抗焦虑、改善心血管系统疾病、抗氧化、抗炎、增强记忆等药理作用[3]。

酸枣仁的药理作用与其成分息息相关，近年来利用LC-MS技术对酸枣仁的成分分析研究较多，而酸枣除药用部位果仁以外，其他部位成分的研究鲜有报道。酸枣的其他部位同样具有药用价值，酸枣叶能改善睡眠[4]，具有保肝[5]、抗氧化、抑菌[6]等作用；酸枣果肉也被证明具有镇静催眠[7]、抗氧化[8]等作用。因此，充分了解酸枣叶及果肉的化学成分可以促进其有效利用。

为了更加简便、快速地分析鉴定中药复杂体系中的化学成分，本研究采用了UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS技术，对宁夏回族自治区石嘴山市北武当贺兰山脚下野生酸枣的不同部位中化学成分进行定性分析，从而了解酸枣不同部位的成分差异，为酸枣叶、果肉功效的深入研究以及野生酸枣的开发利用奠定了理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACQUITY超高效液相色谱系统串联SYNAPT G2-Si质谱仪（美国Waters公司，离子源为电喷雾离子源ESI，配有MassLynx V4.1工作站），超高效液相色谱与质谱联用仪（Thermo Scientific Q Exactive LC-MS）[美国Thermo Fisher公司，离子源为电喷雾离子源（ESI），配有Xcalibur 3.0工作站]，电子天平ME104E/02（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），UNIFI 1.8（美国Waters公司），高速台式冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），MILLI-Q Advantage A10超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 材料

乙腈、甲酸[质谱级，赛默飞世尔科技（美国）有限公司]。水为质谱级超纯水。甲醇（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）。酸枣药材采于宁夏回族自治区石嘴山市北武当贺兰山脚下，经北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定为鼠李科植物酸枣[Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou]的干燥成熟果实及枝叶。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

洗净的酸枣果实、叶片于105℃烘干24 h，取叶片、果肉及果仁粉碎后过4号筛得到粉末，称取酸枣叶、果仁、果肉粉末各0.2 g放入50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL50%甲醇，30℃超声1.5 h，滤过，收集滤液，12 000 r·min-1高速离心10 min，取上清液即得。

2.2 色谱条件

采用UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS技术对酸枣各部位中的化合物进行分析。

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温为35℃，体积流量为0.3 mL·min-1；进样量为5 μL；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～8 min，2%～9%B；8～18 min，9%～32%B；18～20 min，32%～89%B；20～35 min，89%～98%B；35～37 min，98%～2%B，37～40 min；2%B）。

2.3 质谱条件

① 采用SYNAPT G2-Si质谱仪，离子源为ESI，在正离子模式下进行质谱检测分析。辅助喷雾电离与脱溶剂气体使用的是高纯N2，N2温度为120℃；干燥气流速为10 mL·min-1；雾化气气压为310 kPa；脱溶剂N2流速为900 L·h-1；锥孔反吹氮气为50 L·h-1；毛细管电离电压和锥孔电压分别为500 V、40 V；高能通道碰撞能量为40～65 eV；四极杆质量扫描范围：m/z50～1500 Da，扫描时间0.2 s，进行质谱检测分析[9]。

② 采用Q Exactive质谱仪，ESI在负离子模式下进行分析，扫描范围设定为m/z100～1500 Da。具体的质谱条件参数：毛细管电压3200 V；毛细管温度为350℃，离子源温度为350℃；采用高纯N2作为鞘气和辅助气，鞘气流速为35 L·h-1，辅助气流速为15 L·h-1；采用Thermo Xcalibur 3.0工作站处理数据[10]。

2.4 数据分析

利用中国知网（CNKI），SciFinder，PubMed上已有文献与中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索酸枣的化学成分，将检索得到的化学成分进行整合、去除重复项后通过PubChem，ChemSpider等平台或数据库下载各化合物的mol格式的文件，建立酸枣各部分的化学成分信息数据库。

基于MassLynx V4.1工作站和以中药数据库为基础的UNIFI 1.8软件对正离子模式数据进行采集与分析，将酸枣化合物信息条目导入库中，设定高能通道阈值为25.0，低能通道阈值为200.0，选择运行碎片分析功能，选取的相关加和离子为H＋，Na＋，K＋，NH4＋，输入lockmass值（556.2766）校正质量数，设定误差Error的绝对值不超过1.5×10-5。同时也基于文献和人类代谢组数据库（Human Metabolome Database，HMDB，www.hmdb.ca），收集相关化合物的二级碎片和保留时间进行比对，保留时间接近并且误差Error的绝对值不超过1×10-5鉴定为同一化合物。

采用Xcalibur 3.0工作站将Thermo仪器产生的“.raw”格式的负离子模式数据打开，查询相关文献收集化合物的二级碎片和保留时间，保留时间接近并且误差Error的绝对值不超过5×10-6鉴定为同一化合物。

2.5 化学成分的鉴定

野生酸枣仁、叶、果肉样品溶液按 “2.2”和“2.3”项下的色谱及质谱条件进行分析，得到其在正、负离子模式下的BPI图（见图1）。结合UNIFI数据库匹配和已有文献报道以及HMDB数据库比对，确定化合物的分子式及裂解规律，鉴定出黄酮类化合物20种，生物碱类化合物8种，萜类化合物12种，脂肪酸类化合物8种，核苷类化合物5种，氨基酸类化合物5种，有机酸类化合物3种，甾体类化合物1种，总计62种化合物，鉴定结果见表1[11-27]。其中，酸枣仁鉴定出42种化合物，酸枣叶鉴定出41种化合物，酸枣果肉鉴定出28种化合物。

图1 野生酸枣仁（a）、叶（b）、果肉（c）在正离子模式（A）和负离子模式（B）下的基峰离子流图Fig 1 Base peak ion in the positive ion mode（A）and the negative mode（B）in the kernel（a），leaf（b）and sarcocarp（c）of wild sour jujube

表1 UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS法鉴定野生酸枣不同部位的化学成分 Tab 1 Compounds from different parts of wild sour jujube by UPLC-Q-TOF/MSE and UHPLC-Q-Exactive/MS

续表1

续表1

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2.6 化学成分质谱裂解途径分析

从黄酮类、生物碱类、萜类化合物中各选取了一种代表性化合物，对其进行了裂解规律分析。

化合物12：正离子检测模式下，tR为9.86 min，准分子离子峰[M＋H]＋的m/z为286.1471，推测其分子式为C17H19NO3。在二级质谱图中，果仁获得MS/MS碎片的m/z分别为237.1644，209.1044，175.0847，107.0457；叶片获得MS/MS碎片的m/z分别为269.0630，237.1240，209.0350，175.1078；果肉获得MS/MS碎片的m/z分别为237.0501，175.1078，143.0529，107.0547。推测化合物12的二级质谱图中[M＋H]＋失去1分子NH3形成m/z269的[M＋H-NH3]＋碎片离子，[M＋H-NH3]＋失去1分子CH3OH形成m/z237的[M＋H-NH3-CH3OH]＋碎片离子，[M＋H-NH3-CH3OH]＋失去1分子CO形成m/z209的[M＋H-NH3-CH3OH-CO]＋碎片离子；[M＋H]＋失去1分子C6H9NO形成m/z175的[M＋H-C6H9NO]＋碎片离子，[M＋H-C6H9NO]＋失去1分子CH3OH形成m/z143的[M＋H-C6H9NO-CH3OH]＋碎片离子；[M＋H]＋失去1分子C10H13NO2形成m/z107的[M＋H-C10H13NO2]＋碎片离子[14-15]。通过对其裂解过程的分析，初步鉴定化合物为生物碱类成分乌药碱，广泛分布于酸枣的仁、叶、果肉中，具体裂解规律见图2A。

化合物20：正离子检测模式下，tR为12.54 min，准分子离子峰[M＋H]＋的m/z为609.1841，负离子检测模式下，准分子离子峰[M＋H]-的m/z为607.16650，推测其分子式为C28H32O15。在二级质谱图中，获得MS/MS碎片，其m/z分别为447.0494，429.3217，411.0050，381.0122，351.0997，327.0907，323.0921，308.0710，297.0756，267.0688。推测化合物20的二级质谱图中[M＋H]＋失去1分子葡萄糖（162 Da）形成m/z447的[M＋H-Glc]＋碎片离子，[M＋H-Glc]＋失去1分子C4H8O4形成m/z327的[M＋H-Glc-C4H8O4]＋碎片离子，并在此处产生基峰[16]；[M＋H-Glc]＋失去1分子H2O形成m/z429的[M＋H-Glc-H2O]＋碎片离子，[M＋H-Glc-H2O]＋再失去1分子H2O形成m/z411的[M＋H-Glc-2H2O]＋碎片离子，[M＋H-Glc-H2O]＋失去1分子CH4O2形成m/z381的[M＋H-Glc-H2O-CH4O2]＋碎片离子，[M＋H-Glc-H2O]＋失去1分子C2H6O3形成m/z351的[M＋H-Glc-H2O-C2H6O3]＋碎片离子，[M＋H-Glc-H2O]＋失去1分子C5H8O4形成m/z297的碎片离子[17]，通过对其裂解过程的分析，初步鉴定化合物为黄酮类成分斯皮诺素，主要分布在酸枣的果仁和叶片中，具体裂解规律见图2B。

化合物40：正离子检测模式下，tR为19.41 min，准分子离子峰[M＋H]＋的m/z为1207.6130，[M＋NH4]＋的m/z为1224.6335，负离子检测模式下，准分子离子峰[M＋H]-的m/z为1205.5941，推测其分子式为C58H94O26。在二级质谱图中，获得MS/MS碎片，其m/z分别为1057.2031，749.9297，733.5105，455.3582，437.3096。推测化合物40的二级质谱图中，离子断裂途径开始于1分子H2O（18 Da）的中性损失，产生一个不稳定的中间体，其中C20和C22之间产生双键，C16-C17单键和C23-O（C16）单键断裂，不稳定的中间体通过RDA裂解立即转化为m/z1189的离子[M＋H-H2O]＋[18]，[M＋H-H2O]＋失去1分子Xyl形成m/z1057的 [M＋H-Xyl]＋碎片离子，[M＋H-Xyl]＋失去1分子Glc后再失去1分子Glc或Rha形成m/z733的[M＋H-Xyl-2Glc]＋和m/z749的 [M＋H-Xyl-Glc-Rha]＋碎片离子，之后失去所有的糖得到17-Ebelin lactone，形成m/z455的碎片离子峰 [M＋H-C28H47O23]＋，并在m/z437（C30H45O2）处产生一系列的优势产物离子[16]。通过对其裂解过程的分析，初步鉴定化合物为皂苷类成分酸枣仁皂苷A，主要分布在酸枣仁中，具体裂解规律见图2C。

图2 乌药碱（A）、斯皮诺素（B）和酸枣仁皂苷A（C）的推测裂解途径Fig 2 Possible fragmentation pathways for coclaurine（A），spinosin（B）and jujuboside A（C）

3 讨论

3.1 不同部位化学成分差异

黄酮类化合物及萜类化合物主要分布在酸枣的果仁和叶片中，果仁中鉴定出15种黄酮类化合物，5种萜类化合物；叶片中鉴定出11种黄酮类化合物，11种萜类化合物。果肉中鉴定出3种黄酮类化合物，4种萜类化合物，这两类成分在果肉中含量较少、离子强度较低。研究表明，酸枣抗氧化活性成分主要为黄酮类及萜类化合物，总还原能力酸枣叶＞酸枣仁＞酸枣果肉[19]，与本研究中这两类成分种类分布的趋势相符。

黄酮类及萜类化合物也是酸枣主要的镇静安眠成分[20]，果仁中黄酮类化合物种类丰富，萜类化合物的种类比叶片少，然而6'''-对香豆酰斯皮诺素[21]、6'''-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A[22]等具有镇静安眠作用的药效成分主要分布在果仁中，其他药效成分斯皮诺素[22]、当药黄素[23]、酸枣仁皂苷B、山茶苷 B和白桦脂酸[24]主要分布在果仁和叶片中，当药黄素和白桦脂酸分布于三个部位中。酸枣叶片中的黄酮类及萜类成分种类多，这表明酸枣叶也具有很好的镇静安眠作用，与已有的报道相符[25]，具有很大的开发潜力。酸枣果肉中这两类成分种类较少，镇静安眠作用可能比较弱，后续需进行相关药理实验研究证明酸枣不同部位镇静催眠作用的强弱。

生物碱类和脂肪酸类成分在酸枣三个部位分布较均匀，酸枣中的生物碱具有抗惊厥[26]、催眠[27]的作用；果仁中的亚油酸及果肉中的亚麻酸属于不饱和脂肪酸，具有镇静催眠作用[28]。

3.2 野生酸枣资源综合开发与利用

酸枣仁是治疗失眠的各种中药制剂中最常用的组分[29]，酸枣不仅应用于医疗，也应用于食品保健，人们对酸枣的需求量日益增大，近年来各地酸枣仁的价格持续高涨，出现了供不应求的现象。宁夏石嘴山市北武当贺兰山脚下拥有丰富的酸枣资源，但综合开发利用的深度不够。本研究发现，酸枣除果仁部位以外，叶片及果肉也富含黄酮和萜类等活性成分。酸枣叶已被用于开发功能性饮料、食品添加剂、牲畜饲料等产品[30]，但其尚未得到广泛而充分的利用。此外，酸枣叶还可用于提取黄酮和萜类成分，相比于果实的获取受季节限制，叶片无论采摘、贮存和运输都具有较大优势。果肉中活性成分较少，适合开发为果脯类零食，不仅口感更佳，而且具有一定安神的作用，适合常年失眠多梦的患者使用，具有较大的市场需求。

开发贺兰山野生酸枣具有很高的商业价值，但是过度采摘容易造成资源匮乏，破坏野生酸枣种质资源。因此应该在保护野生种质资源的基础上，合理地开发和利用贺兰山野生酸枣资源，实现可持续发展，这不仅可以满足市场的需求，提高酸枣的遗传多样性，还可以为选育抗逆性优良的酸枣新品种提供宝贵的基础材料，也为当地实现产业升级、中草药资源开发和经济转型提供新的思路。

3.3 不足和局限性

本研究也存在一定局限性，首先，由UPLCQ-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS鉴定到的化合物无对照品进行比对，可能存在一定的假阳性情况；其次，研究采用的酸枣数据库都是已知成分，野生酸枣中存在的未知成分尚无法鉴定；再次，本研究仅使用50%甲醇部位进行成分提取研究，提取工艺有待优化；最后，本研究每个部位仅有1个样品，且质谱本身具有灵敏度的局限性，本方法鉴定得到的化合物并不代表酸枣中的全部成分，后续应增加样品数量及实验批次。由于色谱峰数量多而复杂，在离子流图中有一些响应较好的峰尚未定性，因此溶剂、色谱、质谱条件还有待优化，化学成分需要进一步研究。

4 结论

综上分析，本研究采用了UPLC-Q-TOF/MSE和UHPLC-Q-Exactive/MS技术，对宁夏回族自治区石嘴山市北武当贺兰山脚下野生酸枣的不同部位（果仁、叶片、果肉）中化学成分进行定性分析；同时初步探索了贺兰山野生酸枣的种属分布，表明其作为药用酸枣的可行性，有利于在一定程度上缓解酸枣资源供不应求的现状，也为贺兰山野生酸枣资源的综合开发和利用提供依据。