齐多夫定对小鼠糖脂代谢平衡的影响及作用机制

成丽媛，刘 薇，郭笑言，戈晓爱，王丁丁，王 涛*

（1中国药科大学药物科学研究院新药筛选中心，南京 210009；2南京市职业病防治院，南京 210042）

艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征（AIDS），是世界范围内的重大感染性疾病，感染人数还在不断上升［1］。当前，各种抗病毒药物的合理治疗可获得良好的病毒抑制，多数艾滋病患的生活质量和存活时间均得到改善［2］。然而，现有抗病毒药物尚不能完全清除患者体内病毒，随着药物使用时间的延长，药物相关不良症状日益显著，如代谢综合征、糖尿病、慢性肝肾及骨骼疾病等［3-4］，已成为影响艾滋病患者生存质量和预后的主要原因。

齐多夫定（AZT）是第一个被批准用于治疗AIDS 的核苷类逆转录酶抑制剂［5］，也是抗人类免疫缺陷病毒感染的一线药物之一，但是长期用药所引起的机体代谢紊乱限制了其临床疗效发挥［6-7］。目前AZT的不良反应研究主要集中在线粒体毒性方面［8-10］，AZT 可干扰线粒体DNA 的复制或抑制线粒体相关蛋白的合成而造成线粒体损伤［11］，这可能是其诱发糖脂代谢的障碍和失衡的潜在机制。AZT 对于整体糖脂代谢平衡的作用特征及其靶器官目前尚不明确。

正常情况下，机体组织细胞可以利用葡萄糖、脂肪酸等多种能量物质代谢供能，可根据组织环境和能量物质的供应情况，在不同能量代谢底物之间切换［12］，而线粒体则是维持和调节代谢平衡的核心细胞器［13］。基于AZT 诱发的临床代谢失衡症状和潜在的线粒体毒性特征，本研究采用正常小鼠长期给药，考察AZT 对整体糖脂代谢平衡的作用特征，同时探讨肝脏在AZT 所致线粒体毒性和糖脂代谢失衡中的靶器官角色，为其临床安全精准用药及不良反应防治提供实验依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

齐多夫定（CAS：A122924，纯度大于98%，阿拉丁试剂有限公司）；胰岛素注射液（诺和灵30R，丹麦诺和诺德公司）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）；总RNA提取试剂，HiScript®Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆转录试剂盒，AceQ®qPCR SYBR®Green Master Mix DNA 扩增试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；β-actin、葡萄糖转运蛋白（Glut2）、肉碱棕榈酸转移酶（Cpt1α）、中链酰基辅酶A 脱氢酶（Mcad）抗体（美国Proteintech 公司）；Akt、P-Akt 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）。葡萄糖、甘油三脂检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）血生化试剂盒（南京威特曼生物科技有限公司）；非酯化脂肪酸检测试剂盒（日本Wako公司）。所用引物由上海英潍捷基公司合成。

1.2 仪 器

Legend Micro 21R 低温离心机，Varioskan Lux多功能微孔板读数仪，Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪，Applied Biosystems StepOneTM实时荧光定量PCR 仪（美国Thermo 公司）；TL 系列中高通量组织细胞研磨破碎仪（北京鼎昊源科技有限公司）；D1100-230V 恒温金属浴（美国Labnet 公司）；PowerPac™HC 电泳仪电源，Gel Doc XR+凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）；BX53 生物显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 动 物

SPF级雄性ICR小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，购自河南斯克贝斯生物科技有限公司，生产许可证号SCXK（豫）2020-0005。所有动物实验均符合中国药科大学动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 剂量设置及分组

24 只雄性ICR 小鼠随机分为3 组，每组8 只，分别为溶剂对照组（CON）、齐多夫定低、高剂量组（AZT-L、AZT-H）。齐多夫定给药组每天灌胃给予AZT 100，300 mg/kg，溶剂对照组灌胃给予相应体积的蒸馏水，连续12 周。给药结束后禁食12 h 摘眼球采血，颈椎脱臼处死小鼠，分离肝脏。

2.2 血清生化指标检测

12 周给药结束后，分别在禁食6 h 和12 h 后进行眼眶取血，将全血于200 μL 离心管中常温静置30 min 后，4 ℃，3 000 r/min 离心15 min，吸取上层血清至200 μL EP 管中，按血生化试剂盒说明测定血清葡萄糖（GLU）和甘油三酯（TG）水平。

2.3 糖耐量实验

给药结束前7 天，小鼠禁食不禁水12 h 后，灌胃给予2 g/kg 葡萄糖溶液。分别测定给予葡萄糖0，15，30，60，120 min 后小鼠的血糖，计算血糖浓度-时间曲线下面积（AUC）。

2.4 胰岛素耐量实验

给药结束前4天，小鼠禁食不禁水6 h后，腹腔注射0.75 U/kg 胰岛素注射液。分别测定给予胰岛素0，15，30，60，120 min 后小鼠的血糖，计算血糖浓度-时间AUC。

2.5 肝脏指数及肝脂检测

小鼠肝脏用生理盐水漂洗干净，滤纸吸干称重，计算肝脏指数，即肝脏占体重的质量分数。称取肝组织30 mg，加入磷酸盐缓冲液（PBS）研磨，使用BCA 法测定蛋白浓度，吸取肝匀浆上清液测定肝脏组织TG、非酯化脂肪酸（NEFA）水平。

2.6 肝脏病理学检测

取小鼠肝脏左叶中间部分，在4%中性甲醛中固定48 h，然后进行石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红（HE）染色，最后在显微镜下观察肝组织病理学形态变化。

2.7 Western blot检测相关蛋白表达

称取肝组织30 mg，加入RIPA 裂解液提取肝总蛋白，使用BCA法定蛋白，金属浴煮蛋白，-20 ℃保存变性蛋白。取等体积蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，在冰上恒流模式下进行转膜，5% BSA 封闭2 h，4 ℃孵育一抗过夜，一抗为Cpt1α、Mcad、Glut2、Akt、P-Akt 抗体。第2 天用TBST 洗膜，孵育二抗羊抗兔IgG 抗体1 h，再洗膜，采用化学发光法曝光。使用Image J进行蛋白条带的灰度分析。

2.8 RT-PCR检测相关基因表达

称取肝组织30 mg，加Trizol 裂解液1 mL 提取总RNA。使用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度，在逆转录仪上将RNA逆转录成cDNA。运用实时荧光定量PCR 法测定cDNA 样品中的Cpt1α、Mcad、Pepck、G6pase 和Glut2 的基因水平。选用βactin作为内参基因，引物序列如表1所示。

2.9 统计分析

使用GraphPad Prism 6.01 软件进行数据统计处理，实验结果以xˉ± s 表示。组间数据统计分析采用One-Way ANOVA 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR assay

3 结 果

3.1 齐多夫定对小鼠体重及肝脏系数的影响

如图1所示，各组小鼠在给药期间体重均有所上升，而各组间体重及肝脏指数均无明显差异。

Figure 1 Effect of zidovudine(AZT)on the body weight(A)and liver index(B)in mice(xˉ± s,n = 8)CON:Solvent control;AZT-L:Zidovudine(100 mg/kg);AZT-H:Zidovudine(300 mg/kg)

3.2 齐多夫定对小鼠血糖、血脂的影响

如图2血清生化结果显示，随着禁食时间的延长，对照组小鼠血清葡萄糖和甘油三酯水平都显著降低；与溶剂对照组相比，AZT给药对于禁食6 h与禁食12 h 血糖水平无明显影响（图2-A），但却显著抑制禁食12 h血清甘油三酯的降低（图2-B）。

Figure 2 Effect of AZT on serum glucose（A）and triglyceride(TG)(B)in mice after fasting for 6 h or 12 h(xˉ± s,n = 8)*P ＜0.05

3.3 齐多夫定对小鼠糖耐量及胰岛素耐量的影响

如图3 口服糖耐量（OGTT）结果显示，溶剂对照组小鼠灌胃葡萄糖后，血糖在15 min 时达到最大值，之后逐渐下降，120 min 时恢复到基础水平。与对照组相比，低剂量组小鼠血糖无明显变化，而高剂量组小鼠在15 min 和30 min 的血糖明显高于对照组（图3-A）。计算AUC 发现，AZT 高剂量组可明显降低糖耐量水平（图3-B）。

胰岛素耐量（ITT）结果显示，溶剂对照组小鼠注射胰岛素后，血糖急速下降，在30 min 时降到最低，随后90 min 内肝脏糖异生增加使血糖恢复至基础水平。与对照组相比，AZT给药组可以剂量依赖性的增加胰岛素注射后30 min 内的降糖速率，然而，AZT 各剂量组血糖上升趋势明显被抑制，提示小鼠肝脏糖异生能力受损（图3-C）。结果显示AZT明显降低AUC水平（图3-D）。

3.4 齐多夫定对小鼠肝组织病理学的影响

肝脏HE 染色结果如图4 所示，溶剂对照组小鼠肝细胞结构完整，肝索排列整齐，AZT 高剂量组小鼠表现出肝细胞体积增大，胞浆淡染，而低剂量组对小鼠肝脏无明显影响。

3.5 齐多夫定对小鼠肝脏的影响

血清生化结果显示，AZT给药组呈剂量相关性的增加ALT、AST 水平，说明AZT 可导致肝脏受损（图5-A、B）；肝脏组织TG、NEFA 指标明显升高，说明肝脏脂质蓄积（图5-C、D）。

3.6 齐多夫定对小鼠肝脏糖脂代谢基因表达的影响

PCR 结果如图6 所示，与溶剂对照组相比，AZT 给药后参与脂肪酸转运的关键酶Cpt1α 及脂肪酸β 氧化反应第一步的中链酰基辅酶A 脱氢酶（Mcad）基因表达剂量依赖性的下调。而糖代谢相关基因结果显示葡萄糖转运蛋白（Glut2）的基因表达上调，糖异生基因Pepck、G6pase表达呈剂量相关性的下调。结果表明AZT 导致肝脏脂肪酸氧化被抑制，能量缺乏导致糖酵解增强，同时糖异生过程被抑制。

3.7 齐多夫定对肝脏糖脂代谢相关蛋白表达的影响

如图7 所示，与溶剂对照组相比，AZT 给药组脂肪酸转运蛋白Cpt1α表达明显下调，与基因结果一致；Glut2、Mcad 及胰岛素信号通路相关蛋白表达无明显变化。

4 讨 论

新陈代谢是生命体的基本要素，既有整体的特征，也有组织细胞层面的机制。当疾病、损伤、药物等外界因素作用于机体代谢的某个过程，如果超过了机体自身调节能力，即表现为某些代谢失衡特征，甚至诱发多种代谢性疾病［14-15］。

Figure 3 Effect of AZT in oral glucose tolerance test(OGTT)(A)and insulin tolerance test(ITT)(B)(xˉ± s,n = 8)*P ＜0.05, ***P ＜0.001

Figure 4 Effect of AZT on liver histopathology of mice(HE staining,×200)A:CON;B:AZT-L;C:AZT-H

葡萄糖是机体多数组织主要的能量代谢底物，也是多数代谢失衡病症的主要易损指标［17］。本实验中口服糖耐量结果显示，AZT高剂量组出现明显的糖耐量受损，提示机体对于外源性葡萄糖处置能力显著下降。胰岛素耐量结果显示，正常组小鼠血糖曲线先是经历30 min 的快速下降相，再出现90 min 的缓慢上升相，前者是外源性胰岛素的降糖作用，后者则是血糖降低继发的肝糖输出所致，其中肝糖异生发挥主要贡献。与正常小鼠相比，AZT 给药可使得血糖下降相的斜率更大，提示给药组胰岛素的血糖处置能力增强或者敏感性增加；同时血糖上升相接近消失，提示给药组肝脏糖异生作用被抑制。由此可见，AZT 长期给药一方面使得机体处置外源性葡萄糖能力（糖耐量实验）受损，另一方面却又使得胰岛素敏感性增强（胰岛素耐量实验）和肝脏糖异生减弱，表明AZT可损害机体葡萄糖代谢，但是对胰岛素介导的内源性糖代谢无不良影响。

脂肪酸作为另一种主要的能量物质，可与葡萄糖共同参与能量代谢供应，这即是机体代谢灵活性特征之一［18］。本实验中，通过检测禁食（能量匮乏）状态下小鼠血糖、血脂的水平，观察AZT 对糖脂代谢选择性的影响。随着禁食时间的延长，正常小鼠血清葡萄糖和甘油三酯水平都显著降低，表明机体在利用内源性的糖和脂代谢供能；AZT 长期给药对于内源性葡萄糖利用无明显影响，但却显著抑制甘油三酯的代谢利用，表明AZT损害小鼠对能量代谢底物的选择，影响了糖脂代谢平衡。

Figure 5 Effect of AZT on liver of mice(xˉ± s,n = 8)A:Alanine aminotransferase(ALT);B:Aspartate aminotransferase(AST);C:TG D:Non-esterified fatty acids(NEFA)*P ＜0.05, **P ＜0.01,***P ＜0.001

Figure 6 Effects of AZT on gene expression of glycolipid metabolism in mice(xˉ± s,n = 6)*P ＜0.05, ***P ＜0.001 vs CON group

线粒体是糖、脂等能量物质转化的主要场所，在糖脂代谢调节中发挥关键作用［19-20］。在富含碳水化合物的餐后，葡萄糖和胰岛素高时，葡萄糖摄取、糖酵解和丙酮酸氧化增加，脂肪酸氧化受到抑制。在禁食期间，Cpt1α 的活性增加，脂肪酸进入线粒体进行β 氧化［21-22］，脂肪酸利用率的增加会抑制葡萄糖转运蛋白，阻碍葡萄糖的摄取和使用。肝脏是协调全身代谢的的主要器官，也是线粒体含量丰富的器官，在机体代谢调节中具有重要作用［23］。本实验中，AZT 给药组血清转氨酶水平升高，肝脏脂质含量（TG、NEFA）增加，提示肝细胞损害和脂质代谢障碍。AZT 给药组肝脏糖代谢基因表达明显上调，而脂肪酸氧化基因及糖异生基因表达明显下降。AZT 明显抑制Cpt1α 的蛋白水平，但对于糖代谢相关蛋白（Glut2、Mcad 及胰岛素信号通路）表达未见明显影响，提示AZT 长期给药导致肝脏脂肪酸转运受阻，不能通过脂肪酸β氧化来提供能量。由此可见，肝脏是AZT 诱发代谢失衡的潜在靶器官，而肝脏线粒体脂肪酸代谢障碍是其影响代谢平衡的潜在机制。

总之，AZT 长期给药可导致小鼠代谢失衡，主要表现为糖耐量受损和脂肪酸代谢障碍，肝脏是其重要的靶器官，其可能作用机制是通过下调脂肪酸氧化代谢及糖异生基因表达，从而导致肝脏脂质蓄积和糖脂代谢紊乱。机体糖脂代谢的调节是由多器官参与的，器官之间的交叉对话在能量稳态调节中也至关重要，后续研究可继续从代谢平衡调节着手，通过肌肉、脂肪、胰腺等多器官探讨，进一步阐释AZT导致代谢紊乱的机制。

Figure 7 Effect of AZT on the expression of protein relative to glucose and lipid metabolism in mice (xˉ± s,n = 3)A:Glut2;B:Mcad;C:Cpt1α;D:P-Akt/Akt*P ＜0.05 vs CON group