气相色谱法测定药用辅料聚西托醇1000中的残留杂质

李浩宇，唐宝强，何东升*，涂家生**

（1中国药科大学药学院药用辅料及仿创药物研发评价中心，南京 210009；2国家药品监督管理局药物制剂及辅料研究与评价重点实验室，南京 210009）

聚西托醇1000（又称聚乙二醇十六烷基醚），是一种常见的药用辅料，化学式为CmH2m+1（OCH2CH2）nOH（m = 16，n ～20），本品由十六醇与一定数量的环氧乙烷通过缩合反应制得，产品中聚乙二醇的重复单元在2 ～20 之间，当n=20 时即为聚西托醇1000（商品名Brij-58）［1］。聚西托醇1000 在药物制剂领域应用广泛，常作为乳剂、乳膏、气雾剂的非离子O/W 型乳化剂和挥发油的增溶剂等，在药物控释、增溶等方面具有重要作用［2］。然而，在临床应用中，含有聚西托醇1000作为乳化剂的乳膏存在多例患者发生医源性过敏性皮炎的案例［3］，因此，建立良好的方法检测聚西托醇1000有关杂质对于控制本品的质量并保障患者用药安全具有重要意义［4］。

在聚西托醇1000 的生产中，环氧乙烷作为主要原料可能残留于产物中，与其相关的副产物还包括1，4-二氧六环、乙二醇及其次级副产物二甘醇和三甘醇等。环氧乙烷对黏膜和皮肤具有一定的刺激性，是世界卫生组织列出的一类致癌物，短时间内少量吸入即可引起明显的中枢神经毒性［5］；1，4-二氧六环则为二类致癌物，对皮肤黏膜有刺激性，误服可导致肝肾毒性［6］；乙二醇、二甘醇和三甘醇等均对人体有一定的毒性［7］，可通过食入、吸入和经皮吸收侵入机体并主要表现为中枢神经、心肺和肝肾毒性［8-9］。这些残留杂质不仅会影响产品质量，更具有潜在的安全风险，有必要对其进行检测和控制。

现行聚西托醇1000的质量标准主要收载于英国药典BP2020［10］、美国药典USP43-NF38［11］和国际药典Ph. Int-Tenth Edition［12］中，《中华人民共和国药典》（2020 版）［13］尚未收录该品种。在杂质检查项下，BP2020和USP43-NF38仅要求检查环氧乙烷杂质，对于生产过程中可能存在的1，4-二氧六环、乙二醇、二甘醇和三甘醇杂质的检查存在缺失。本研究在参考国内外药典标准和相关辅料生产企业标准的基础上，首次对聚西托醇1000 中环氧乙烷、1，4-二氧六环、乙二醇、二甘醇和三甘醇等杂质建立了针对性的气相色谱检测方法。所建立的方法能有效测定聚西托醇1000 中的有关杂质，为生产工艺改进以及保障患者用药安全提供了科学依据。

1 材 料

1.1 仪 器

Trace 1300 气相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司）配备氢火焰离子化检测器（FID）及自动进样器；SECURA25-1CN、BSA124S电子天平（德国Sartorius公司）；VF-17MS 气相色谱柱（30 m × 0.53 mm，1 μm），DB-1 气相色谱柱（30 m×0.32 mm，5 μm）（美国安捷伦科技有限公司）；Omni-A 独立超纯水系统（厦门瑞思捷科学仪器有限公司）。

1.2 试剂与药品

乙二醇（纯度≥99.5%，批号：L1902032）、二甘醇（纯度≥99.5%，批号：H1814132）、乙醇（色谱级，纯度≥99.5%，批号：J2027121）、乙醛（纯度≥99.5%，批号：E2107134）、N，N-二甲基乙酰胺（色谱级，纯度≥99.9%，批号：A2115160）、1，4-二氧六环标准品（纯度≥99.7%，批号：L2011016）（上海阿拉丁试剂有限公司）；三甘醇（纯度≥99.0%，批号：L1712031）、1，3-丁二醇（纯度≥99.0%，批号：ZLCGF-DM）（上海梯希爱化成工业发展有限公司）；环氧乙烷水溶液（1.85 mg/mL，中国食品药品检定研究院，批号：190255-202001）；聚西托醇1000 样品由生产企业赠送（A 公司，批号记为A1、A2、A3、A4和A5；B公司，批号记为B1、B2和B3）。

2 方法与结果

2.1 环氧乙烷和1,4-二氧六环的检测

2.1.1 溶液配制

供试品溶液：取本品1.0 g，精密称定，置于顶空瓶中，精密加入N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL 和水0.2 mL，密封，摇匀，作为供试品溶液。

环氧乙烷对照品储备液：精密量取环氧乙烷水溶液0.15 mL 于25 mL 量瓶中，用水定容得质量浓度为11.1 μg/mL的溶液。

1，4-二氧六环对照品储备液：精密称取1，4-二氧六环50 mg于50 mL量瓶中，用水稀释成约1 mg/mL 的溶液。再精密量取1 mL 于20 mL 量瓶中，用水定容得质量浓度为50 μg/mL的溶液。

对照品混合储备液：精密称取1，4-二氧六环50 mg 于20 mL 量瓶中，用水稀释成约2.5 mg/mL的溶液，精密量取0.5 mL 于25 mL 量瓶中，另精密量取环氧乙烷水溶液0.15 mL于该量瓶中，用水定容得环氧乙烷质量浓度为11.1 μg/mL 同时1，4-二氧六环质量浓度为50 μg/mL 的对照品混合储备液。

对照品溶液：取本品1.0 g，精密称定，置于顶空瓶中，精密加入环氧乙烷和1，4-二氧六环对照品储备液各0.1 mL，再精密加入N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL，密封，摇匀。

系统适用性溶液：精密量取环氧乙烷和1，4-二氧六环对照品溶液各0.1 mL 置于顶空瓶中，加入新配制的0.001%乙醛水溶液0.1 mL，再精密加入N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL，密封摇匀。

2.1.2 色谱条件及测定方法 使用安捷伦DB-1色谱柱（以聚二甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，5 μm）），顶空进样。起始温 度 为35 ℃，维 持5 min，以5 ℃/min 升 温 至180 ℃，再以30 ℃/min 升温至230 ℃，维持5 min。进样口温度为150 ℃，氢火焰离子化检测器温度为250 ℃，顶空平衡温度为70 ℃，平衡时间45 min。进样体积1000 μL，分流比5∶1。取样品注入气相色谱仪，按标准加入法计算。

2.1.3 系统适用性和专属性 取空白溶剂（N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL 加水0.2 mL 的混合溶液）、系统适用性溶液和供试品溶液顶空进样分析，检测结果见图1。保留时间分别为：乙醛3.077 min，环氧乙烷3.930 min，1，4-二氧六环15.768 min。环氧乙烷和1，4-二氧六环理论塔板数均大于10 000，信噪比均大于10，空白溶剂和样品在目标峰出峰位置无干扰，各相邻峰的分离度均大于2.0，表明该方法专属性良好。

Figure 1 Chromatograms of blank solution(A),system suitability solution(B)and reference solution(C)1:Acetaldehyde;2:Ethylene oxide;3:1,4-Dioxane

2.1.4 线性 称量样品1.0 g，精密称定6份置于顶空瓶中。依次精密移取对照品混合储备液各0、0.10、0.20、0.30、0.40 和0.50 mL 于顶空瓶中，并再往第一份和第二份样品中分别补加水0.2 mL和0.1 mL。然后按顺序依次精密量取N，N-二甲基乙酰胺1.0、1.0、1.0、0.9、0.8、0.7 mL 加至顶空瓶内，密封摇匀，得到线性测试溶液：环氧乙烷加样量分别为0、0.555、1.11、1.665、2.22 和2.775 μg/g；1，4-二氧六 环加样 量分别 为0、2.512、5.023、7.535、10.046和12.558 μg/g。每个加样量组平行配制3 份溶液，取上述溶液进样分析，以各样品峰面积对加样量（μg/g）作图并进行线性拟合。检测结果见表1。

结果显示，环氧乙烷在0 ～2.775 μg/g 的加样范围内线性良好，在各加样量下的RSD 均小于6%，线性方程y=0.035 1x-0.000 7，r=0.999 5；1，4-二氧六环在0 ～12.558 μg/g 的加样范围内线性良好，在各加样量下的RSD 均小于9%，线性方程y=0.009 9x-0.001 9，r=0.999 4。

Table 1 Linearity of ethylene oxide and 1,4-dioxane(xˉ± s,n = 3)

2.1.5 进样精密度 平行制备6 份对照品溶液，进样分析。结果显示，环氧乙烷和1，4-二氧六环峰面积的RSD 分别为7.4%和4.0%（n = 6），表明色谱系统进样精密度良好。

2.1.6 检测限与定量限 取样品约1.0 g，精密称定于顶空瓶中，分别加入不同体积的环氧乙烷对照品储备液和1，4-二氧六环对照品储备液，补足水至水相体积到0.2 mL 后，各精密量取1.0 mL 的N，N-二甲基乙酰胺加入顶空瓶，配制成含有不同环氧乙烷和1，4-二氧六环加样量的溶液，进样分析。当信噪比为3 和10 时，分别为仪器对环氧乙烷和1，4-二氧六环的检测限定量限。结果显示，环氧乙烷的检测限（S/N=3）为0.222 μg/g，定量限（S/N = 10）为0.888 μg/g，1，4-二氧六环的检测限（S/N = 3）为1.501 μg/g，定 量 限（S/N = 10）为3.503 μg/g。

2.1.7 回收率 称量聚西托醇1000 样品（B1）1.0 g 共6 份，精密称定，置于顶空瓶中。依次分别加入环氧乙烷对照品储备液和1，4-二氧六环对照品储备液各0.10 mL，然后依次精密量取N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL加入顶空瓶，密封摇匀，配制成环氧乙烷加样量为1.11 μg/g及1，4-二氧六环加样量为5.023 μg/g 的回收率溶液。另取样品1.0 g，精密称定，置于顶空瓶中，精密加入水0.2 mL 和N，N-二甲基乙酰胺1.0 mL 加至顶空瓶内，用于测量空白本底值。将各溶液进样分析，检测结果见表2。

结果显示，在该加样水平下，环氧乙烷平均回收率为90.6%，1，4-二氧六环平均回收率为101.2%，环氧乙烷和1，4-二氧六环的RSD 均小于8.0%，符合《中华人民共和国药典》（2020 版）要求。

Table 2 Recovery of ethylene oxide and 1,4-dioxane(xˉ± s,n = 6)

2.1.8 样品含量测定 取共8 批次样品按照“2.1.1”项下的方法配制供试品溶液和对照品溶液，并照“2.1.2”项下色谱条件进样分析，按标准加入法计算各批次样品中环氧乙烷和1，4-二氧六环的含量。结果显示，8 批样品中，仅A1 和A2 批次样品分别检出环氧乙烷1.9 和0.8 μg/g，其余批次环氧乙烷均未检出。所有批次样品均未检出1，4-二氧六环。

2.2 乙二醇、二甘醇和三甘醇的检测

2.2.1 溶液的配制

内标溶液：取1，3-丁二醇适量，精密称定，加无水乙醇配制成质量浓度为4 mg/mL的内标溶液。

对照品储备溶液：取乙二醇、二甘醇和三甘醇适量，精密称定，用无水乙醇溶解并稀释制成各样品浓度均为4 mg/mL的混合溶液。

对照品溶液：精密移取对照品储备溶液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，精密移取内标溶液1.0 mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

供试品溶液：取本品4.0 g，精密称定，置100 mL量瓶中，精密加内标储备液1.0 mL，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

线性对照品溶液：称量乙二醇、二甘醇和三甘醇适量，精密称定，用无水乙醇溶解并稀释成各样品浓度均为0.75 mg/mL的线性对照品溶液。

线性内标溶液：取1，3-丁二醇适量，精密称定，加无水乙醇配制成质量浓度为1 mg/mL 的内标溶液。

回收率对照品溶液：称量乙二醇、二甘醇和三甘醇适量，精密称定，用无水乙醇溶解并稀释成各样品质量浓度均为1.25 mg/mL 的线性对照品溶液。

回收率内标溶液：取1，3-丁二醇适量，精密称定，加无水乙醇配制成质量浓度为1 mg/mL 的内标溶液。

2.2.2 色谱条件 使用安捷伦VF-17MS 色谱柱（以50%苯基-50%甲基聚硅氧烷为固定液的石英毛细管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）），液体进样；起始温度60 ℃，维持5 min，以5 ℃/min升温至110 ℃，维持5 min，再以2 ℃/min升温至170 ℃，维持5 min，再以35 ℃/min升温至280 ℃，维持30 min。进样口温度为270 ℃，氢火焰离子化检测器温度为290 ℃。取对照品溶液作为系统适用性溶液进样，要求乙二醇、二甘醇和三甘醇色谱峰之间的分离度不得小于2.0。载气为氮气，分流比2∶1，流速4 mL/min，进样体积1.0 μL。取供试品溶液和对照品溶液注入气相色谱仪，按内标法以峰面积计算。

2.2.3 系统适用性和专属性 分别取空白溶剂（无水乙醇）、对照品溶液、供试品溶液进样分析，结果见图2。保留时间分别为：乙二醇5.313 min，1，3-丁二醇10.968 min，二甘醇14.935 min，三甘醇29.628 min。乙二醇、二甘醇、三甘醇理论塔板数均大于20 000，各相邻峰的分离度均大于1.5，空白溶剂和样品在目标峰出峰位置无干扰，表明该方法专属性良好。

2.2.4 线 性 依次精密移取0.1、0.5、1、1.5 和2 mL 线性对照品溶液于25 mL 量瓶中，再各精密加入线性内标溶液1.0 mL，加无水乙醇定容得到线性测试溶液，其中1，3-丁二醇质量浓度均为40.168 μg/mL，乙 二 醇 分 别 为3.009、15.046、30.092、45.138 和60.184 μg/mL，二甘醇分别为3.047、15.236、30.472、45.708 和60.944 μg/mL，三甘醇分别为3.016、15.082、30.164、45.246 和60.328 μg/mL。以各样品与内标峰面积之比对各样品浓度作图，并进行线性拟合。

结果显示，乙二醇在3.009 2 ～60.184 0 μg/mL的范围内线性良好，线性方程为y = 0.016 2x -0.010 9，r=0.999 5；二甘醇在3.047 2 ～60.944 0 μg/mL的范围内线性良好，线性方程为y=0.016x-0.015 1，r=0.999 7；三甘醇在3.016 4 ～60.328 0 μg/mL的范围内线性良好，线性方程为y=0.014x-0.030 9，r=0.999 4。

2.2.5 进样精密度 平行制备6 份对照品溶液，进样分析。结果显示，乙二醇、二甘醇和三甘醇与内标峰面积之比的RSD 分别为2.3%、1.3%和2.7%（n=6），表明色谱系统进样精密度良好。

2.2.6 检测限与定量限 取不同体积的对照品储备溶液于100 mL 量瓶中，用无水乙醇稀释至不同浓度，当信噪比为3 和10 时，分别为各样品的检测限和定量限。结果显示，乙二醇的检测限（S/N=3）为1.942 μg/mL，定量限（S/N=10）为5.665 μg/mL；二甘醇的检测限为1.567 μg/mL，定量限为3.254 μg/mL；三甘醇的检测限为1.112 μg/mL，定量限为3.567 μg/mL；1，3-丁二醇的检测限为0.707 μg/mL，定量限为1.768 μg/mL。

2.2.7 回收率 取聚西托醇1000 样品（B1 批）1.0 g 共9 份分成3 组，精密称定，置25 mL 量瓶中，精密加入回收率内标溶液1.0 mL，再分别精密量取回收率对照品溶液0.4、0.5 和0.6 mL 加入量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，配制成低（20 μg/mL）、中（25 μg/mL）和高（30 μg/mL）3 种质量浓度的回收率供试溶液。

另取样品（B1 批）1.0 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，精密移取1.0 mL 回收率内标溶液后加无水乙醇溶解并稀释至刻度，用于测量空白本底值。另精密量取回收率对照品溶液0.5 mL 至25 mL 量瓶中，精密加入回收率内标溶液1 mL，加无水乙醇定容，用于测量校正因子。将各溶液分别进样分析，检测结果见表3。

结果显示，各加样浓度下，乙二醇回收率均在101%～103%，二甘醇回收率均在96%～103%，三甘醇回收率均在100%～103%，RSD 均小于3.0%，均符合《中华人民共和国药典》（2020版）要求。

Table 3 Recovery of ethylene glycol,diethylene glycol and triethylene glycol(n=3)

2.2.8 样品含量测定 取共8 批次样品按照“2.2.1”项下的方法配制供试品溶液和对照品溶液，并照“2.2.2”项下色谱条件进样分析，按内标法以峰面积计算各批次样品中乙二醇、二甘醇和三甘醇的含量。检测结果见表4。

结果显示，8 批样品中，A1 和A2 批次乙二醇、二甘醇和三甘醇含量相对于其他批次较大，其余批次乙二醇、二甘醇和三甘醇含量均小于0.01%。

3 讨 论

本研究所建立的检测方法主要参考了《中华人民共和国药典》中部分与聚西托醇1000 化学结构及制备工艺相似品种的现行检测方法，并在其基础上加以改进使其更适合本品的检测，参考品种包括聚乙二醇1000、聚氧乙烯50 硬脂酸酯和聚氧乙烯油酸酯等。

3.1 环氧乙烷和1,4-二氧六环的测定

检测过程中发现，在参考品种所规定的杂质限度下，由于环氧乙烷和1，4-二氧六环的对照品溶液浓度较低，两者的对照溶液进样后峰面积均较小，信噪比低难以达到仪器的定量限，重复性和线性较差。因此通过调整进样分流比至5∶1，实现了在不提高样品浓度情况下使目标峰可稳定达到仪器检测限，各杂质峰均满足检测要求。

Table 4 Content of ethylene glycol, diethylene glycol and triethylene glycol in 8 batches samples

3.2 乙二醇、二甘醇和三甘醇的测定

由于聚西托醇1000的化学结构和所参考的其他辅料存在一定差异，因此在直接采用参考品种的检测方法进行系统适用性和专属性分析时，三甘醇与杂质不能有效分离。通过调整升温程序，将110 ～170 ℃升温时的升温速率由15 ℃/min 降低到2 ℃/min 进而提高三甘醇和杂质的分离度，同时调整进样分流比至2∶1 以提高信噪比来保证后续检测的重复性。调整后的方法可使各批次样品中乙二醇、二甘醇和三甘醇均能良好分离并满足检测要求。样品检测结果显示，部分批次中的3种杂质含量较高，具有潜在风险，因此增加对这3 类杂质的检测对产品的质量控制具有重要意义。

4 总 结

本研究建立了适用于聚西托醇1000中环氧乙烷、1，4-二氧六环、乙二醇、二甘醇和三甘醇等残留杂质的气相色谱检测方法，所建立的方法具有良好的专属性、线性、精密度和回收率，检测灵敏度高，涵盖的杂质种类多。同时，本研究还通过测定收集到的8批样品中的残留杂质，为聚西托醇1000残留杂质的检测和限度控制提供了参考依据，为药用辅料质量标准的建立提供了理论支撑。