几种葡萄酒色素抗氧化活性的密度泛函理论分析

张 恒 炜， 李 子 贤， 刘 佳 瑞， 王 一， 侯 英 敏

(大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034)

0 引 言

葡萄酒的颜色是评价其质量好坏的指标之一，葡萄酒中最主要的呈色物质为花色素类化合物[1-2]。花色素属于黄酮化合物，是一种天然的水溶性色素，在葡萄的转色期主要以游离形式出现，随着葡萄的成熟，花色素在葡萄中的含量不断增加，花色素主要有五类：矢车菊素、飞燕草素、芍药素、矮牵牛素、锦葵素[3]。

花色素在自然界中通常是以与葡萄糖结合而形成的花色苷形式存在，花色苷是有效的抗氧化剂[4-6]，当被转换为稳定的芳香基时，会快速减少氧化物质，达到抗氧化作用。花色苷中有儿茶酚核，可以螯合过度的金属离子(阻止羟基的产生)，潜在地参与氧化应激。在年轻的葡萄酒中，最主要的花色苷是锦葵色素葡萄糖苷，在弱酸性环境下，由于酸碱平衡和水化异构，每个花色苷实际上都是有色和无色的混合物。在葡萄酒陈酿过程中，有色和无色的花色苷可以与包括乙醛(乙醇的氧化产物)、原花青素、4-羟基苯乙烯在内的其他葡萄酒成分发生反应，生成一些新的葡萄酒色素[7]。

本实验采用密度泛函理论，对锦葵色素葡萄糖苷(色素A)、儿茶酸(色素B)、锦葵色素葡萄糖苷通过CH3—CH桥与儿茶酸连接而形成的两个手性异构体(色素C和C′)及锦葵色素葡萄糖苷与儿茶酸直接相连而形成的色素(色素D)分子抗氧化活性进行了研究。5个葡萄酒色素分子结构如图1所示。

(a)色素A

1 计算方法

采用Gaussian 16程序包、B3LYP泛函[8]和TZVP基组[9]对5个色素分子的几何构型进行优化，确保优化构型无虚频。使用pop=full对物质的电子结构进行了计算。并用Multiwfn软件[10-11]对葡萄酒色素分子几何结构参数、电子布局、HOMO和LUMO的能级、结构、片段贡献率进行了分析，并用VMD软件绘制图像[12]。

2 结果与讨论

2.1 分子的几何构型与结构参数

运用B3LYP/TZVP方法优化得到的色素A、B、C、C′、D的分子结构如图2所示，主要结构参数如表1所示。

(a)色素A

葡萄酒色素属于花青素类化合物，对于花青素类化合物来说，其抗氧化活性取决于苯环上的酚羟基与自由基发生H转移的难易程度以及发生H转移后所形成的自由基的稳定性。若酚羟基易与自由基发生H转移，则说明其抗氧化活性较高。反之则表示抗氧化活性较弱。由此可见，判断葡萄酒色素抗氧化活性的强弱的一个重要指标就是其酚羟基的数量和位置[13]。

在5种葡萄酒色素中，均是A环上的C5和C7处有酚羟基取代，而B环和C环上的取代基因为物质不同而存在差异。色素A、C、C′、D的C环C3位连接的是葡萄糖苷，B环C13、C15位连接的是氧甲基，而色素B的C3位连接的是羟基，B环C13、C15位连接的是酚羟基。如表1所示，5种色素在A环C5位、B环C14位连接羟基的键长近似相等，由色素A、B反应得到色素C、C′、D，在A′、B′环上的酚羟基键长也都近似相等。而C7位连接的羟基键长则各不同，通过CH3—CH桥将色素A和B连接形成的色素C、C′在此处的键长比色素A、B和直接相连形成的色素D的键长都长，所以通过CH3—CH桥将色素A和B连接后，可以提高此处抗氧化活性。

表1 5种葡萄酒色素的主要结构参数

从整体来看，5种葡萄酒色素中A环C7位和B环C14位的酚羟基活性最强，而A环和C环的其他酚羟基都具有一定的活性。将色素A和色素B通过两种方式连接而形成的色素C、C′、D在B’环C15’处的酚羟基活性相对较强。

2.2 自然键轨道(NPA)电荷分子

生物体内的含氧自由基都在氧原子端带有较多的负电荷，根据“异性相吸，同性相斥”的原理，带负电荷的基团容易进攻正电荷多的原子，所以生物体内的含氧自由基就更会更容易进攻正电荷多的原子。由于花青素类化合物消除自由基主要通过与自由基发生H转移反应的，所以葡萄酒色素分子上酚羟基H原子所带的正电荷越多，则越易与含氧自由基发生H转移反应，能够清除的体内自由基也就越多，其抗氧化活性也就越强[14]。

利用Guassian软件对5种葡萄酒色素进行电荷计算，得到酚羟基上H原子的NPA电荷数，如表2所示。从表2中可以看出，5种葡萄酒色素在C7和C14位的酚羟基的电荷数都比较大，所以此处的抗氧化活性较高，这也与其结构参数得出的结论一致。色素B的NPA电荷数显著低于其他4种色素，推测色素B的抗氧化活性是5个葡萄酒色素中最弱的。将色素A和色素B连接后，B′环上C7、C14′、C15′处的酚羟基电荷数较多，推测这些地方可能是葡萄酒色素发生抗氧化反应的活性位点。通过CH3—CH桥连接而形成的两个手性异构的色素C和C′在各个酚羟基处电荷数大体相同，所以构型的不同对抗氧化活性几乎没有影响。

表2 5种葡萄酒色素羟基H原子上的NPA电荷数

2.3 前线分子轨道能级分析

前线轨道理论揭示了参与化学反应的主要的轨道是前线分子轨道中的最高的电子占据轨道(HOMO)和最低的电子非占据轨道(LUMO)。E(HOMO)越高，表示电子越不稳定。反之，E(LUMO)越低，表示更易接收电子。而最低的电子非占据轨道(LUMO)和最高的电子占据轨道(HOMO)的能级差(ΔE)越小，意味着分子越活泼、反应活性也就更强。

ΔE可以作为葡萄酒色素分子抗氧化活性强弱的依据之一[15]，葡萄酒色素的ΔE越小，表示它的抗氧化活性越强。表3为在B3LYP/TZYP计算水平下优化的5种葡萄酒色素分子LUMO、HOMO的能级和ΔE。由表3可知，色素A、C、C′、D的E(HOMO)和ΔE接近，ΔE均在0.09 a.u.左右。表明将色素A和B无论是通过CH3—CH桥相连还是直接相连，都不能明显提高其抗氧化活性，且R和S构型的抗氧化活性也大致相同。而色素B的抗氧化活性则显著地低于其他4种色素，推测与其C环结构有关。

表3 5种葡萄酒色素的E(HOMO)、E(LUMO)及ΔE

2.4 各片段对前线分子轨道的贡献

利用Multiwfn软件和VMD软件对5种葡萄酒色素的前线分子轨道(HOMO、LUMO)进行绘制，如图3所示。前线分子轨道图可以直观地对分子中参与反应的活性部位的分布情况进行定性分析。一个分子HOMO轨道电子云密度越大，则表示其易与自由基发生反应，是发生抗氧化反应的主要位点。

由5种葡萄酒色素分子的HOMO图可以看出，电子云主要分布在色素A分子的B环上，色素B分子的电A环上，由色素A和B经不同连接方式生成色素C、C′、D的电子云主要分布在B′环上。除了色素B没有糖苷外，其他色素分子在糖苷处都很少有电子云分布。

5种葡萄酒色素分子的LUMO轨道差别不大，电子云主要分布在A、B、C环上，色素C、C′、D的A′、B′、C′环均无明显电子云分布。与HOMO轨道一样，4种葡萄酒色素分子的糖苷处也没有LUMO轨道分布。

前线轨道结构图只能对HOMO、LUMO轨道进行定性分析，并不能进行定量分析，不能精确地得出每个片段对轨道的贡献度，所以在得到前线轨道结构图的基础上，又通过Multiwfn软件对5种葡萄酒色素的酚羟基对前线分子轨道的贡献率进行计算，结果如表4所示。

由图3和表4可以看出，色素A的C14位羟基占据HOMO轨道较多，即反应活性也较强；色素B的C7位酚羟基所占比例较大，可以推测对于色素B而言，A环C7位的酚羟基反应活性较大，这也与H原子NPA电荷分析的结果一致。其他3种色素在将色素A和B相连后，活性位点由原来的B环转移到了B′环，在C14′、C15′处的HOMO轨道比例较大。综合对HOMO轨道的贡献率和NPA电荷数可以得出，此处的反应活性较大，具有较大的抗氧化能力，是自由基与其发生抗氧化反应的主要作用位点。

(a)色素A HOMO

表4 5种葡萄酒色素的酚羟基占据前线分子轨道比例

3 结 论

本文主要运用密度泛函理论，对葡萄酒中的5种色素进行计算，分析得到其抗氧化活性的强弱和抗氧化反应的活性位点结果表明，5种色素在C7和C14处均有较强的反应活性，将色素A和B通过CH3—CH桥连接形成的色素C，C′和直接相连形成的色素D在B′环的C14′，C15′处有着较强的反应活性，这些位置的羟基可能是发生抗氧化反应的主要作用位点。色素B的抗氧化能力明显低于其他4种色素，通过CH3—CH桥连接形成的两个手性异构的葡萄酒色素C和C′的ΔE差别不大，所以手性异构对其抗氧化能力的强弱没有影响。CH3—CH桥的引入也对葡萄酒色素的抗氧化能力没有较大影响。