苏尼特羊宰后成熟过程中单磷酸腺苷活化蛋白激酶活性、糖酵解与肉品质指标的变化分析

杨致昊，刘 畅，窦 露，侯艳茹，陈晓雨，苏 琳，赵丽华，靳 烨*

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

冷鲜肉是指动物屠宰后将胴体迅速进行冷却，使胴体温度降为0～4 ℃，并在此温度下加工、贮运、销售的肉类。冷鲜肉经历了比较充分的解僵-成熟过程，同时，在低温环境下肉的表面形成一层干的油脂膜，不仅能够减少肌肉内部的水分蒸发，使肉质柔软多汁，而且可阻止微生物的侵入和繁殖，延长肉的保藏时间。羊肉在经过充分的成熟后，肉质变得柔软且有弹性、色泽鲜艳、口感好。此外，肉品本身含有一定的风味物质前体化合物，在成熟过程中发生一系列的化学变化，能够显著提高肉的风味和整体接受度。李桂霞等对宰后羊肉品质进行研究，结果发现，与宰后1 d的肉相比，成熟7 d的羊肉亮度提升，剪切力下降；保水性则随着宰后成熟时间的延长而降低。杨文婷等对羊宰后背最长肌的研究也得出了类似的结论。Bruce等研究发现，经历了宰后成熟的牛肉具有特殊的咸味或烧烤香味。而这一系列变化都可能与宰后机体内单磷酸腺苷活化蛋白激酶（monophosphateactivated protein kinase，AMPK）被激活有关。

羊屠宰后，机体内氧气供应中断，各种需氧型生物化学反应变为无氧型生物化学反应，造成动物体内的ATP含量急剧减少，导致AMP与ATP比值增大，从而激活了AMPK。作为真核细胞的能量感受器，AMPK参与调控宰后肌肉的能量代谢，尤其是糖酵解途径。研究发现糖酵解与肉色、pH值、嫩度和风味等肉质性状密切相关。宰后肉AMPK活力的高低会直接影响pH值下降的快慢，进而影响肉品的色泽、持水性等指标。研究表明，处于饥饿应激下的绵羊，宰后肉的AMPK活力增加、糖原含量减少、乳酸浓度和剪切力增加。

本实验以苏尼特羊为研究对象，通过对宰后羊肉AMPK含量和活性的变化规律进行研究，探讨宰后羊肉AMPK的含量与活性对宰后羊肉糖酵解和成熟进程的影响，明确AMPK含量和活性的变化与肌肉品质的关系，确定苏尼特羊宰后最佳的成熟时间，旨在为研究羊宰后肌肉的生理变化提供数据支持，进而为改善冷鲜羊肉品质提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苏尼特羊购自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗哈拉图嘎查顺遂农牧农业合作社。

绵羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）含量酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、绵羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated AMPK，p-AMPK）活力ELISA试剂盒江苏酶免实业有限公司；肌糖原含量试剂盒（A043-1-1）、乳酸（A019-2-1）含量试剂盒 南京建成生物工程研究所；葡萄糖含量检测试剂盒（BC2505） 北京Solarbio科技有限公司。

1.2 仪器与设备

C-LM3B嫩度仪 北京天翔飞域仪器设备有限公司；CR-400型色差仪 日本柯尼卡美能达公司；pH-STAR型胴体直测式pH计 北京赛多利斯科学仪器有限公司；XHF-DY型高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；5810-R型低温台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；TU-1810型紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；Trace1300、ISQ型气相色谱-质谱（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）联用仪美国赛默飞世尔科技公司；固相微萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的前处理

选取6只健康无病体质量相近的苏尼特羊，屠宰后取背最长肌分为5等份，在4 ℃条件下进行宰后成熟。在宰后的0、24、48、72、96 h分别测定pH值、剪切力和色泽。同时在每个时间点取2 g左右样品置于无菌无酶管于液氮中存放，之后转移到实验室并于－80 ℃冰箱中保存，用于后续指标的测定。另取100 g左右的样本，在－20 ℃条件下冷冻保存，用于挥发性风味物质的测定。

1.3.2 p-AMPK质量浓度与活力测定

分别取宰后0、24、48、72 h和96 h的肌肉样品0.5 g，加入至4.5 mL的质量分数0.85%的生理盐水，3 000 r/min冰浴匀浆。样品充分匀浆后，3 000 r/min离心10 min，收集上清液利用相应试剂盒测定p-AMPK质量浓度与活力。

1.3.3 糖酵解相关指标测定

pH值的测定：使用pH-STAR型胴体直测式pH计进行测定，每个样本测定3 次，记录并取平均值。

肌糖原和乳酸含量测定：宰后0、24、48、72 h和96 h的肌肉样品（0.5 g）中加入4.5 mL的质量分数0.85%盐水，3 000 r/min冰浴匀浆。样品充分匀浆后，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集上清液并利用相应试剂盒进行肌糖原和乳酸含量测定。

葡萄糖含量测定：称取宰后0、24、48、72 h和96 h的肌肉样品0.1 g，加入1 mL蒸馏水，研磨成匀浆，置于沸水浴中煮沸10 min（盖紧，防止水分散失），冷却后，8 500 r/min、25 ℃离心10 min，取上清液并利用相应试剂盒进行葡萄糖含量测定。

1.3.4 肉品质指标测定

1.3.4.1 剪切力的测定分别在宰后0、24、48、72 h和96 h取背最长肌，将沿肌纤维方向切好的肌肉组织用蒸煮袋封好，于85 ℃水浴锅中加热煮至肉的中心温度为70 ℃，取出后用滤纸擦干表面水分并在室温下冷却。沿肌纤维方向将其切成3 cmh1 cmh1 cm形状的肉块，使用嫩度仪对每个样品测定5～6 次剪切力，记录并计算平均值。

1.3.4.2 蒸煮损失率的测定

分别在宰后0、24、48、72 h和96 h，将样品单独放入塑料袋中并记录其煮前质量（/g），然后75 ℃水浴，数字温度计测量中心温度，达到70 ℃后保持20 min。晾至室温后，擦干表面水分，记录其煮后质量（/g）。蒸煮损失率按式（1）计算。

1.3.4.3 色泽的测定

分别在宰后0、24、48、72 h和96 h使用色差仪测定样品的色差值（亮度*值、红绿度*值、黄蓝度*值），每个肉样测定3 次，记录并取平均值。

1.3.5 挥发性风味物质的测定

将宰后0、24、48、72 h和96 h的样品解冻，切成肉糜（去除筋膜）后称取5 g，置于20 mL采样瓶中，将萃取头插入采样瓶中，60 ℃吸附40 min后取出，随后插入GC进样口，250 ℃解吸3 min。

GC-MS条件：TR-5色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm），载气为He；载气流速1.0 mL/min；进样品和接口温度250 ℃；升温程序为初始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升温到200 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升温到230 ℃，保持5 min，不分流进样；离子源温度250 ℃；保持5 min，再以20 ℃/min升温到230 ℃，保持5 min，不分流进样；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围/35～400；溶剂延迟1 min。

1.3.6 关键挥发性风味物质的确定

采用相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）法确定关键风味物质，定义对样品风味贡献最大的物质ROAV＝100，其他挥发性物质ROAV按式（2）计算。

式中：ROAV为相对气味活度值；Cr为各挥发性物质的相对含量/%；T为各挥发性物质对应的感觉阈值；为对试样总体风味贡献最大物质的相对含量/%；为对试样总体风味贡献最大物质相对应的感觉阈值。所有物质均满足0≤ROAV≤100，其中ROAV≥1为关键挥发性风味物质，ROAV越大的物质对样品整体风味的贡献也越大。

1.4 数据统计分析

利用SPSS 22.0软件进行Duncan’s差异显著性分析（以＜0.05表示差异显著），并采用Excel 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 苏尼特羊宰后成熟过程AMPK变化

羊屠宰后，机体内氧气供应中断，能量水平发生了改变，从而激活了AMPK，被激活的AMPK能够参与调控机体糖代谢，进而影响肉品的剪切力、色泽和持水性等指标。p-AMPK能够激活AMPK的级联效应，因此用p-AMPK来表征AMPK。苏尼特羊宰后成熟过程中p-AMPK质量浓度和活力变化分别如图1、2所示。

图1 苏尼特羊宰后成熟过程中p-AMPK质量浓度的变化Fig.1 Variation in content of p-AMPK during post-mortem aging of Sunit lamb meat

图2 苏尼特羊宰后成熟过程中p-AMPK活力的变化Fig.2 Variation in p-AMPK activity during post-mortem aging of Sunit lamb meat

由图1、2可知，苏尼特羊宰后肌肉中p-AMPK的质量浓度和活力都呈现先上升后下降的趋势，并在24 h达到最高。高永芳等的研究结果显示宰后牛肉中的p-AMPK活力也呈现先上升后下降的趋势，本实验结果与其一致。动物被屠宰初期，机体缺少氧气的供应，肌肉中的糖代谢方式由有氧氧化转变为无氧酵解，造成动物体内ATP的含量急剧下降，AMP/ATP比值上升，这种状态激活了AMPK，因此p-AMPK的质量浓度和活力升高。而随着成熟时间的延长，无氧酵解产生了大量乳酸，导致pH值下降，当低于酶的最适pH值后，AMPK变性失活，p-AMPK的质量浓度和活性不断下降。

2.2 苏尼特羊宰后成熟过程糖酵解指标的变化

糖酵解在生物体内广泛存在，被认为是对生物体具有重要意义的中心代谢途径，动物屠宰后主要依靠糖酵解途径分解糖原进行供能，而糖酵解的最终产物是乳酸，乳酸不断地堆积引起肌肉pH值的变化。pH值是胴体成熟过程评价肉质的重要指标，宰后肌肉pH值下降速度和程度影响肌肉蛋白特性，进而对肉质产生影响。由表1可知，随宰后成熟时间的延长，24 h内pH值显著下降（＜0.05），24 h后变化趋于稳定，说明糖酵解反应几乎终止，这与李文博等的研究结果一致。由表1可知，在宰后成熟过程中，肌糖原和游离葡萄糖含量整体呈现下降的趋势。分析其原因主要是机体无法从外界获取能量，同时AMPK受缺血、缺氧的刺激被激活，被激活的AMPK活化了糖原磷酸化酶，从而加快了肌糖原的分解，使得肌糖原含量不断下降。李泽在羊肉中注射了AMPK专一激活剂5-氨基咪-4-甲酰胺核苷（5-amino-4-imidazolecarboxamide，AICAR）后发现，与对照组相比，注射AICAR能够加快宰后成熟过程中肌肉糖酵解的进程。乳酸作为糖酵解的产物，其含量随着成熟时间的延长呈现先上升后下降的趋势，在成熟24 h最高。0～24 h乳酸含量的增加是因为无氧条件下糖原通过糖酵解大量生成乳酸。而在48～96 h期间乳酸含量无显著差异，可能是由于成熟后期糖原含量下降，糖酵解速率减缓。

表1 苏尼特羊宰后成熟过程中糖酵解指标的变化Table 1 Variation in glycolysis indexes during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.3 苏尼特羊宰后成熟过程肉品质指标的变化

2.3.1 剪切力

剪切力是肉嫩度最直接的反映，剪切力越大说明嫩度越差。动物被屠宰后经历僵直、解僵和成熟的不同过程，剪切力也随之发生变化。动物屠宰初期，肌球蛋白和肌动蛋白发生不可逆的结合，生成肌动球蛋白，引起永久性的肌肉收缩，结果形成外观上僵硬（僵直）的状态。随着宰后成熟时间的延长，在一些内源酶的作用下，肌肉的结构被破坏，僵直解除，剪切力开始下降，肌肉成熟。由图3可知，随着宰后成熟时间的延长，剪切力先逐渐上升，且在24 h达到最大值，表明僵直主要发生在宰后0～24 h内，可能的原因是钙蛋白酶体系在低pH值环境下活性低，不利于钙蛋白酶发挥降解肌肉蛋白的活性，24 h后开始解僵，pH值升高，钙蛋白酶活性升高，剪切力逐渐减小，Kannan等的研究结果也显示羊在宰后24 h的剪切力最高，本研究结果与其相符。

图3 苏尼特羊宰后成熟过程中剪切力的变化Fig.3 Variation in shear force during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.3.2 蒸煮损失率

保水性是影响羊肉品质的关键因素，较低的蒸煮损失率可以在一定程度上反映羊肉有较好的保水性。由图4可知，随着宰后成熟时间的延长，羊肉的蒸煮损失率总体呈现先升高再降低再升高的变化趋势，0～24 h的蒸煮损失率显著低于宰后成熟的其他时间点（＜0.05），说明宰后24 h内的保水性好。宰后96 h蒸煮损失率达到最大值，可能是由于此时的pH值接近肌肉蛋白质的等电点，蛋白质产生了静电荷效应，分子之间的静电斥力减小，使其网状结构处于紧缩状态，肌肉内部空间变小，保水性降低。

图4 宰后不同成熟时间苏尼特羊肉蒸煮损失的变化Fig.4 Variation in cooking loss during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.3.3 色泽

肉的色泽是影响消费者购买行为和鲜肉货架期的一个重要因素，是判断肉品质的一个重要指标。肌肉颜色的深浅主要取决于肌肉中血红蛋白和肌红蛋白的含量和状态，同时还与肌纤维的类型、状态及水分分布有很大关系。由表2可知，*值在宰后96 h达到最大，可能是宰后pH值的变化造成的。宰后肌肉的pH值会下降到蛋白质等电点，使蛋白质分子不带电，对水分子的吸引力下降，肌肉的保水性下降，水分渗出，堆积在肉块表面，从而增强了光的反射。苏尼特羊宰后成熟过程中*值及*值均呈现先升高后平缓的趋势。*值在0～24 h显著升高（＜0.05），分析其原因主要是肌肉中的肌红蛋白与氧气结合形成氧合肌红蛋白，呈现出鲜红的颜色。在96 h有下降趋势，这是由于随着成熟时间的延长，肌红蛋白和氧气充分接触产生高铁肌红蛋白，高铁肌红蛋白呈暗红色，使肉色变暗，*值降低。*值在0～24 h显著升高的原因可能是肌肉与氧气充分接触后，肌肉中的脂肪被氧化，从而使*值增加。

表2 苏尼特羊宰后成熟过程中羊肉色泽的变化Table 2 Variation in color parameters during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.4 苏尼特羊宰后成熟过程中挥发性风味物质的变化

2.4.1 挥发性风味物质种类

挥发性风味物质是肉中香味的重要来源，其种类和含量是评价羊肉品质优劣的重要依据。本实验中检测出5 类挥发性风味物质，共计103种，其中醛类13种、醇类24种、酮类11种、烃类26种、其他类化合物29种。由图5可知，宰后0、2、48、72 h和96 h的挥发性风味物质分别为29、30、41、40、46种，挥发性风味物质种类整体呈现升高的趋势。这与Watanabe等测定牛肉成熟过程中挥发性风味物质的数量变化趋势一致。呈现这种趋势的可能原因是在宰后成熟过程中，AMPK被活化后迅速抑制乙酰辅酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）活性，降低ACC mRNA的表达从而减少脂肪酸合成，同时加速脂肪酸氧化过程，进而加速脂肪代谢。此外，机体内的风味前体物质如游离脂肪酸、氨基酸和核苷酸等会随着脂肪氧化、蛋白水解等化学过程的变化而变化，其中释放出来的某些短链游离脂肪酸会产生强烈的气味，而中链和长链游离脂肪酸会进一步氧化，产生额外的挥发性风味物质，从而促进了挥发性风味物质的形成。

图5 苏尼特羊宰后成熟过程中挥发性风味物质种类Fig.5 Changes in composition of volatile flavor compounds during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.4.2 关键挥发性风味物质

本实验检测出的挥发性风味物质种类较多，但并非每种都对羊肉的风味形成起决定性作用，因此，采用ROAV法来确定羊宰后成熟过程中的关键挥发性风味物质，并结合各物质的气味特性进行分析。表3为苏尼特羊宰后不同时间的关键挥发性风味物质及相应ROAV。其中，ROAV≥1的物质是肉中的关键风味物质，ROAV越大，代表该物质对整体的风味贡献度越大，而0.1≤ROAV＜1的物质对整体风味也有比较重要的辅助作用。

由表3可知，宰后羊肉不同成熟时间的风味存在一定差异，但关键挥发性风味物质的组成相互交叉，共有的关键挥发性风味物有己醛、庚醛、壬醛和1-庚醇。这几种物质在罗玉龙等的研究中也被确定为关键风味物质。醛类物质主要来源于脂肪的氧化和降解，其阈值较小，因此对羊肉的风味形成有重要的作用。本实验中检测到的宰后48 h的醛类物质种类最多（图5）；关键风味物质中醛类的含量也最多，这与王柏辉等的研究结果相同，可能是p-AMPK激活了丙二酰单酰辅酶A脱羧酶，导致丙二酰单酰辅酶A含量的降低，加速脂肪酸氧化而造成的。宰后成熟过程中戊醛、庚醛、苯甲醛和壬醛的相对含量均显著低于宰后0 h（＜0.05），可能的原因是随着成熟时间的延长，p-AMPK的含量和活力整体呈逐渐下降趋势，对于脂肪酸氧化和甘油三酯分解的促进作用降低，同时醛类物质被进一步被氧化成酸和其他物质，导致含量下降。壬醛是由油酸氧化所形成的，可赋予羊肉油脂香、花香和橙香，在羊肉宰后成熟过程中的相对含量较高，且阈值相对较小，对羊肉的整体风味贡献最大（ROAV＝100）。在徐薇薇等对宁夏滩羊的研究中，壬醛也是贡献最大的风味物质。庚醛的ROAV在宰后48 h最大，其赋予羊肉奶酪味、油脂香、花香和橙香；己醛具有鲜草味，其含量会直接影响肉类的风味，成熟96 h时，己醛的含量显著高于0 h（＜0.05）。有研究表明宰后成熟过程中己醛含量的增加可能会引起羊肉风味劣变。醇类物质是脂肪降解的另一种产物，其中1-庚醇对风味的贡献度在宰后48 h最大，赋予了羊肉油脂香、酒香；1-辛烯-3-醇是脂肪氧化酶作用于花生四烯酸而形成的，具有蘑菇味和发酵味，对于羊肉挥发性气味有重要影响。1-辛烯-3-醇在宰后0 h并未被检测出，48 h时相对含量达到最大值，随后又显著下降（＜0.05）。整体上，宰后成熟时间对羊肉挥发性风味物质的形成具有较大影响，随着成熟时间的延长，风味物质的丰富度有所提高，关键风味也发生了变化。

表3 苏尼特羊宰后成熟过程中关键挥发性风味物质及相应ROAVTable 3 Relative odor activity value (ROAV) of critical volatile flavor substances during post-mortem aging of Sunit lamb meat

3 结 论

在宰后成熟过程中，苏尼特羊肉中p-AMPK的质量浓度和活性都呈现先上升后下降的趋势，并在宰后成熟24 h达到最高；糖酵解指标中，pH值在宰后成熟0～24 h内显著下降（＜0.05），24～96 h趋于稳定；肌糖原和游离葡萄糖含量呈现逐渐下降的趋势，宰后成熟48 h后趋于稳定；乳酸含量在成熟24 h到达最高点，48 h后逐渐趋于平缓。在肉品质指标中羊肉的剪切力在宰后成熟24 h达到最大值，随后下降，48 h后趋于稳定；*值在宰后成熟96 h最大，*值及*值在宰后均呈现先升高后平缓的趋势；宰后成熟过程中挥发性风味物质种类整体呈现升高的趋势，其中48 h的醛类物质种类最多、含量最高，可能有助于提高羊肉的整体风味；共有的关键挥发性风味物质包括己醛、庚醛、壬醛和1-庚醇。总体上，宰后不同时间点AMPK含量和活性的变化会造成糖酵解指标的改变，进而影响肉品质指标的变化，同时AMPK含量和活性的改变会影响宰后成熟过程中部分挥发性风味物质的含量与ROAV；苏尼特羊被屠宰48 h后，肌肉中的pH值、糖原和乳酸的含量趋于稳定，嫩度开始改善，风味物质种类增多，这表明成熟48 h后羊肉具有较好的品质和风味，适宜加工食用。