日粮添加沙葱及其提取物对羊肉膻味脂肪酸沉积及贮藏期肉品质的影响

刘旺景，李书仪，唐德富*，敖长金,*

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

自20世纪70年代以来，我国约有1/3的草原因过度放牧而退化，舍饲或者半舍饲快速育肥已经成为我国养羊业生产的主流模式。然而肉羊因放牧转为舍饲会导致羊肉风味和品质下降，原因在于，随着货架期的延长，羊肉中的脂质和蛋白质易发生氧化变质，同时羊肉色泽和风味发生恶化，易产生酸臭味，滋生腐败菌，从而造成大量胴体损失和浪费。有研究表明约50%的肉类损失发生在货架期，造成的主要原因是氧化和腐败；另一方面，集约化养殖所引起的问题日益凸显，例如肉羊运动量减少、日粮组成单一和群发性疾病等，多种应激条件下导致羊肉品质下降、膻味加剧。过去，抗生素被用来缓解由环境胁迫造成的肉羊生产和生长过程中发生的问题，以提高其生产性能和肉品质，然而由于抗生素滥用引发的食品安全和环境污染问题日益凸显，我国于2020年7月1日起，全面禁止在动物饲料中添加抗生素，在此背景下，寻找抗生素的替代品显得尤为重要。

沙葱为百合科（Liliaceae）葱属（）植物，广泛分布在内蒙古、甘肃、青海等地，本课题组前期研究发现，舍饲肉羊日粮中添加沙葱及其提取物能够显著改善羊肉品质和风味，发挥生物学活性作用的物质主要是黄酮类化合物和多酚类化合物。4-烷基支链脂肪酸（4-甲基辛酸、4-甲基壬酸和4-乙基辛酸）又称膻味脂肪酸，是导致羊肉产生膻味的主要物质，因此，降低膻味脂肪酸的沉积，改善羊肉风味，能够极大提高羊肉的市场认可度和接受度，前期本课题组研究结果证实沙葱及其提取物能够显著降低羊肉脂肪中膻味脂肪酸的沉积量，同时对脂肪肉色也有一定的改善作用，原因在于沙葱及其提取物中的黄酮和多酚类化合物具有抗氧化活性，能够延缓氧化反应进程，改善肉色，提高羊肉品质。关于沙葱及其提取物的研究目前集中在改善动物生产性能、免疫及抗氧化等方面，然而缺少它们对羊肉货架期品质影响的研究，同时对膻味脂肪酸沉积的研究多集中于肉羊脂肪组织，缺少对其肌肉组织的报道。本实验以小尾寒羊公羊为研究对象，旨在研究日粮中添加沙葱及其提取物对小尾寒羊背最长肌4-烷基支链脂肪酸沉积的影响，并探讨其对货架期内羊肉品质、肉色及微生物生长等指标的影响，为寻找抗生素替代品和天然防腐剂的研发提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙葱干粉购自内蒙古阿拉善盟浩海生物有限公司。沙葱水提物及沙葱醇提物由实验室自提，得率分别为34%和28%。

4-甲基辛酸、4-甲基壬酸、4-乙基辛酸、十一烷酸（纯度均大于98%） 德国Sigma Aldrich公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒（A015-1）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活力试剂盒（A001-1）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力试剂盒（A005-1） 南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FDU-2110真空冷冻干燥机 东京理化器材株式会社；FW135中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；Epoch全波长酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；Opto-star肉色测定仪 德国MATTHAUS公司；Trace 1310 ISQ气相色谱-质谱仪 美国Thermo Fisher公司；Sailham恒温恒湿培养箱 东莞正航仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计与样品采集

实验选取3 月龄体质量相近（（23.67±3.43）kg）、体况良好的健康小尾寒羊公羊60只，随机分为4 组，每组3个重复，每个重复5只。实验组以每只羊计，分别在基础日粮中添加沙葱粉10 g/d、沙葱水提物3.4 g/d 和沙葱醇提物2.8 g/d 。沙葱水提物中的活性成分为半胱氨酸衍生物、大蒜素、苯并吡喃衍生物和黄芪苷衍生物，沙葱醇提物中的主要活性成分为烷烃、氨类化合物、醇类、酸类和酚类化合物。实验设计及动物日常管理与本课题组前期研究方法一致。基础日粮参照美国国家科学研究委员会（United States National Research Council，NRC）（2007）肉羊的饲养标准中规定的营养需要量进行配制，其组成及营养水平见表1。实验周期为75 d，其中预试期为15 d，正试期为60 d。正试期结束后从每组每个重复挑选2只体质量相近的小尾寒羊屠宰，取胴体左侧背最长肌（约100 g），去除皮下脂肪，于－80 ℃保存，用于膻味脂肪酸的检测。用无菌刀片分割剩余背最长肌，分装于透气型聚氯乙烯包装袋中，将包装好的样品放置在冷藏柜中，（4.0±0.5）℃条件下，分别放置1、3、5、7 d和9 d，以模拟超市羊肉的销售状况。检测不同贮藏期内羊肉脂肪和蛋白质氧化状态、抗氧化能力、pH值、肉色、汁液损失及微生物生长变化情况。

表1 基础日粮组成及营养水平（以干质量计）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (on a dry matter basis)

1.3.2 膻味脂肪酸的富集与检测

膻味脂肪酸（4-甲基辛酸、4-甲基壬酸和4-乙基辛酸）的富集与检测方法参照Kaffarnik等的方法。

1.3.3 羊肉货架期测定指标

1.3.3.1 酸价、过氧化值和挥发性盐基氮含量的测定

用直接滴定法测定酸价（acid value，AV）。将5 g肌肉样品与30 mL石油醚-乙醇混合。然后在混合物中滴入3 滴酚酞指示剂，并用0.05 mol/L KOH溶液滴定溶液，直到混合液呈红色且在30 s内不褪色，其结果以每千克背最长肌所消耗KOH的质量表示，单位为mg/kg。根据Richards等的方法测定样品中的过氧化值（peroxide value，POV），结果用每克蛋白质中羰基的物质的量表示，单位为nmol/g。根据Lee等的方法测定挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量，结果用每克蛋白质中羰基的物质的量表示，单位为nmol/g。

1.3.3.2 总抗氧化能力、总超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽过氧化物酶活力和硫代巴比妥酸反应物值的测定

取15 g待测肌肉样品与生理盐水按照1∶9（/）混合，并用高速均质机均质（5 000 r/min、10 min），在冰浴条件下获得上清液。使用试剂盒检测T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力，单位均为U/mg pro。按照Lynch等所述方法，检测样品硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，结果用每千克肉中丙二醛质量表示，单位为mg/kg。

1.3.3.3 pH值、肉色和汁液损失率的测定

采用便携式pH计测定pH值，随机选取每个样品6个位点测定并取平均值。肉色测定使用Opto-star肉色测定仪，在环境温度为15～22 ℃条件下进行，随机选取每个样品6个位点，测定亮度*值、红绿度*值、黄蓝度*值、饱和度*和色相角。汁液损失的检测参照王燕荣的方法进行。

1.3.3.4 微生物的检测

取15 g肌肉组织与质量分数0.1%无菌蛋白胨水溶液以1∶9（/）的比例混合，得到稀释液，稀释液再与无菌蒸馏水以1∶10（/）的比例混合，取0.1 mL混合液接种到标准微生物计数琼脂平板上，（37±2）℃下培养48 h，计算细菌总数。将0.1 mL混合液接种于MRS琼脂平板上37 ℃厌氧培养96 h，计算乳酸菌数；另将0.1 mL混合液接种于CFC琼脂平板上，20 ℃下培养24 h，计算假单胞杆菌数。结果均以lg（CFU/g）表示。

1.4 数据处理与分析

实验数据采用Microsoft Excel 2010软件进行整理，使用SAS 9.2软件中的方差分析程序进行单因素方差分析，实验羊屠宰后取背最长肌样品用来分析沙葱及其提取物对背长肌中膻味脂肪酸沉积的影响，用GraphPad Prism 5软件包绘制箱线图以呈现结果。使用SAS 9.2软件中PROC MIXED模块对各组贮藏期样品的脂肪和蛋白质氧化程度、抗氧化能力、pH值、肉色、汁液损失率和微生物生长进行分析。该模型的固定效应是日粮处理、贮藏期及两者的交互作用效应，日粮处理效应用来评估贮藏期内（9 d）4 组样品相关指标的变化情况，贮藏期效应用来评估3 组处理组（沙葱组、沙葱水提物组和沙葱醇提物组）样品在不同贮藏阶段（1、3、5、7 d和9 d）相关指标的变化情况，其中随机效应是绵羊个体，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 沙葱及其提取物对羊肉膻味脂肪酸沉积的影响

沙葱及其提取物对羊肉中4-甲基辛酸、4-乙基辛酸和4-甲基壬酸沉积的影响见图1。与对照组相比，日粮中添加沙葱及其提取物能够高度显著降低羊肉中4-甲基辛酸、4-乙基辛酸和4-甲基壬酸的沉积量（＜0.001），同时沙葱水提物组背最长肌中4-甲基辛酸和4-乙基辛酸的沉积量高度显著低于沙葱粉组（＜0.001）。4-甲基辛酸在对照组、沙葱粉组、沙葱醇提物组和沙葱水提物组中沉积量平均值分别为4.46、1.97、1.49 mg/kg和1.21 mg/kg。4-乙基辛酸在对照组、沙葱粉组、沙葱醇提物组和沙葱水提物组中沉积量平均值分别为1.57、0.69、0.51 mg/kg和0.41 mg/kg。4-甲基壬酸在对照组、沙葱粉组、沙葱醇提物组和沙葱水提物组中沉积量平均值分别为0.32、0.17、0.11、0.09 mg/kg。3种膻味脂肪酸在各组背最长肌沉积量均呈对照组＞沙葱粉组＞沙葱醇提物组＞沙葱水提物组的规律。

图1 沙葱及其提取物对羔羊背最长肌中4-甲基辛酸（A）、4-乙基辛酸（B）和4-甲基壬酸（C）沉积的影响Fig.1 Effects of Allium mongolicum Regel and its extracts on 4-methyloctanoic acid (A), 4-ethyloctanoic acid (B), and 4-methylnonanoic acid (C) concentrations in Longissimus dorsi muscle of lambs

2.2 日粮和贮藏期对羊肉脂肪和蛋白质氧化的影响

由表2可知，日粮和贮藏期对AV、POV和TVB-N含量均有高度显著影响（＜0.001），同时日粮和贮藏期的交互作用对AV和POV（＜0.05）以及TVB-N含量（＜0.001）有显著影响。贮藏期间，AV和TVB-N含量在前3 d无显著性变化（＞0.05），从第5天开始背最长肌脂质和蛋白质氧化程度总体显著升高（＜0.05）。日粮中添加沙葱及其提取物总体能够显著降低背最长肌中AV、POV和TVB-N含量（＜0.05），只有沙葱醇提物组中POV与对照组相比无显著性差异（＞0.05）。

表2 日粮和贮藏期对羔羊背最长肌AV、POV和TVB-N含量的影响Table 2 Effects of diet and storage time on the AV, POV, and TVB-N content in Longissimus dorsi muscle of lambs kept under retail display conditions

2.3 日粮和贮藏期对羊肉抗氧化指标的影响

由表3可知，日粮和贮藏期对T-AOC、T-SOD活力、GSH-Px活力和TBARS值均有显著影响（＜0.05、＜0.01、＜0.001），同时日粮和贮藏期的交互作用对GSH-Px活力有显著影响（＜0.05），对T-AOC、T-SOD含量和TBARS值无显著性影响（＞0.05）。与对照组相比，日粮中添加沙葱及其提取物能够显著提高T-AOC、T-SOD活力、GSH-Px活力，降低TBARS值（＜0.05）（除沙葱醇提物组），从而提高背最长肌的抗氧化能力。整个贮藏期内，T-AOC先增加后下降，最后趋于平稳；T-SOD和GSH-Px活力呈先下降后升高再下降的趋势；TBARS值呈先升高后趋于平稳的趋势。

表3 日粮和贮藏期对羔羊背最长肌T-AOC、T-SOD活力、GSH-Px活力和TBARS值的影响Table 3 Effects of diet and storage time on T-AOC, T-SOD, GSH-Px, and TBARS level of Longissimus dorsi muscle in lambs

2.4 日粮和贮藏期对羊肉pH值、肉色和汁液损失率的影响

由表4可知，贮藏期对pH值、肉色和汁液损失率均有高度显著性影响（＜0.001）；同时日粮和贮藏期的交互作用对羊肉pH值、肉色和汁液损失率均无显著性影响（＞0.05）；日粮对pH、*、和*值无显著性影响（＞0.05），与对照组相比，日粮中添加沙葱及其提取物能够显著降低（＜0.05），沙葱水提物能够显著降低*值和汁液损失率（＜0.05），且日粮中添加沙葱粉也能够显著降低汁液损失率（＜0.05）。整个贮藏期内，pH值、*值和随时间的延长总体呈显著升高的趋势，背最长肌*值呈先升高后趋于平稳的趋势；*值和*值随时间的延长总体呈显著降低的趋势；汁液损失率呈先升高后稳定的趋势。

表4 日粮和贮藏期对羔羊背最长肌pH值、肉色和汁液损失率的影响Table 4 Effects of diet and retail display period on the pH, color, and juice loss percentage of Longissimus dorsi muscle in lambs

2.5 日粮和贮藏期对羊肉微生物菌落的影响

由表5可知，日粮和贮藏期的交互作用对菌落总数、乳酸菌和假单胞菌数无显著性影响（＞0.05）。与对照组相比，日粮中添加沙葱及其提取物能够显著降低背最长肌中的菌落总数（＞0.05），而对乳酸菌和假单胞菌数无显著性影响（＞0.05）。整个贮藏期内，菌落总数和乳酸菌数呈先稳定后增加的趋势，假单胞菌落数随着时间的延长呈增加的趋势。

表5 日粮和贮藏期对羔羊背最长肌微生物菌落的影响Table 5 Effects of diet and retail display period on microbial counts of Longissimus dorsi muscle in lambs

3 讨 论

羊肉具有的膻味是其消费总量远低于其他畜产品的主要原因。众多研究表明4-甲基辛酸、4-乙基辛酸和4-甲基壬酸是羊肉膻味的主要贡献者。Kaffarnik等研究发现4-甲基辛酸在绵羊皮下脂肪中含量最丰富，其次是4-乙基辛酸和4-甲基壬酸，本研究在绵羊背最长肌中也发现类似规律。风味阈值是物质能够被感知的最小气味浓度，其与风味强度呈显著负相关关系，有关研究表明，3种4-烷基支链脂肪酸中4-乙基辛酸的风味阈值最低，在pH 2的介质中其阈值约为0.006 mg/kg，但其对羊肉风味的贡献度大于76%。本实验研究发现日粮中添加沙葱及其提取物能够显著降低绵羊背最长肌中3种4-烷基支链脂肪酸的沉积量，这与本课题组先前研究结果一致，Liu Wangjing等研究发现小尾寒羊日粮中添加沙葱黄酮能够显著降低羊肉中4-甲基辛酸的沉积，对羊肉风味有一定的改善作用。反刍动物瘤胃微生物可利用丙酸、戊酸等挥发性脂肪酸合成奇数碳原子脂肪酸，也可利用异丁酸、异戊酸及支链氨基酸合成支链脂肪酸。Du Hongxi等证实沙葱及其滤渣能够改变绵羊瘤胃微生物区系，而缬氨酸和亮氨酸等氨基酸的降解为瘤胃微生物菌群合成支链脂肪酸提供前体物，提示沙葱及其提取物中的活性成分可能通过改变瘤胃微生物菌群组成，使支链脂肪酸合成相关途径受到影响，从而降低背最长肌中4-烷基支链脂肪酸的沉积量。从膻味物质4-烷基支链脂肪酸的合成途径来看，丙二酰辅酶A脱羧酶是支链脂肪酸合成途径的关键酶，在支链脂肪酸的合成中丙酸是重要前体，丙酸除了能被肝脏代谢外，还能转化为甲基丙二酰辅酶A，当二酰辅酶A脱羧酶活性较高时，能够增加组织对甲基丙二酰辅酶A的利用率，参与到脂肪酸的从头合成中，生成甲基支链脂肪酸，沙葱及其提取物是否能够抑制丙二酰辅酶A脱羧酶的活性，以降低肌肉组织中4-烷基支链脂肪酸的沉积还有待进一步研究。

脂肪和蛋白质氧化是影响羊肉品质的主要因素，本研究发现背最长肌中脂肪和蛋白质氧化程度不仅受日粮的影响，而且随着货架期的延长而加剧。先前有研究报道沙葱水提物和醇提物中的活性成分黄酮和多酚含量均高于沙葱粉，因而具有更强的抗氧化活性。Brewer等研究发现酚类化合物作为氢供体能够提高抗氧化活性。而黄酮类化合物能够通过调节抗氧化酶相关基因的表达来抑制促氧化酶，增强机体抗氧化力。同时日粮中的活性成分如多酚、黄酮类化合物能以单体形式被动物吸收，一些活性成分（如-生育酚）在瘤胃中不发生降解，可直接进入肠上皮细胞，随血液运送到全身，从而发挥抗氧化功效。Dong Yongzhe等的研究证实在小鼠肠道中沙葱中的活性成分黄酮和多酚在降低机体POV和TVB-N含量方面发挥关键性作用，这可能也是本实验中背最长肌脂肪和蛋白质氧化程度降低的主要原因。AV和TVB-N含量在贮藏前3 d处于平台期，从第5～9天显著增加，原因是随着贮藏期的延长，沉积到绵羊背最长肌中的活性成分发生降解和氧化，导致羊肉脂肪和蛋白质氧化程度加剧。总的来说，沙葱及其提取物延缓了羊肉脂质和蛋白质氧化的进程。

沙葱及其提取物中含有的黄酮类及多酚类活性物质是提高绵羊背最长肌抗氧化能力的主要原因。内源性抗氧化酶SOD和GSH-Px是动物过氧化防御系统的主要参与者，大量研究表明，日粮中添加沙葱粉、多糖和黄酮类化合物能够显著提高动物总抗氧化能力和内源性抗氧化酶（SOD和GSH-Px）的活性。丙二醛是多不饱和脂肪酸氧化的主要产物，其含量通常被用来衡量氧化应激和细胞损伤的程度。本研究发现，日粮中添加沙葱及其提取物能够显著降低背最长肌TBARS值，提示沙葱及其提取物能够降低机体氧化应激和细胞损伤。近期也有研究发现，在绵羊日粮中添加富含抗氧化活性物质的葡萄籽和绿茶提取物能够通过提高羊肉中抗氧化酶的活性，从而延长羊肉的贮藏期。另外，本实验发现随着货架期的延长，背最长肌暴露在空气中，由于氧化反应进程的推进，背最长肌中丙二醛及其他氧化产物的含量逐渐增多，可能是造成不良风味产生的原因之一。

在整个贮藏期内背最长肌pH值呈先增加（前3 d），然后进入平台期（第3～5天），最后呈现再次增加的趋势，羊肉在贮藏初期肌肉中的糖原会转化为乳酸，导致pH值的降低，而pH值升高的主要原因是背最长肌中蛋白质分解产生NH和胺类物质，但从总体上看，贮藏期内背最长肌pH值处于正常范围（5.6～6.4）内。肉色值在货架期前3 d逐渐增加，主要原因是蛋白质发生水解，化学结构发生变化因而导致光分散程度增加，影响值；第3～9天无显著变化，可能的原因是黄酮和多酚类物质是一种天然的铁螯合剂，能降低被测样品中肌红蛋白浓度，延缓值的增加趋势。肉色值在贮藏期第3～5天趋于稳定，这与沙葱及其提取物的抗氧化活性有关，第5～9天值下降的主要原因是背最长肌中肌红蛋白氧化，高铁肌红蛋白合成增多。肉色值通常与消费者对羊肉的接受程度密切相关，Chelh等研究发现，脂质和蛋白质氧化过程中产生一种Schiff色素（即脂褐素），会导致羊肉值的增加，本研究结果表明，与对照组相比，日粮中添加沙葱及其提取物总体能够显著降低羊肉值，提示沙葱水提物中的抗氧化活性成分发挥了作用。色相角（）是反映羊肉随贮藏期延长褐变程度的综合性指标，本研究结果提示沙葱及其提取物显著降低，有效延缓羊肉褐变。Ortuno等研究发现在羔羊日粮中添加迷迭香提取物能够显著降低羊肉，这与迷迭香提取物的抗氧化活性相关。另外本研究发现日粮中添加沙葱及其水提物能够显著降低羊肉的汁液损失率，贮藏期内第1～7天汁液损失率显著升高，原因是肌肉中含有丰富的游离金属离子和肌红蛋白等氧化诱导物，随着贮藏期的延长，抗氧化酶系统逐渐崩溃，氧化诱导物的存在导致羊肉脂质和蛋白质的氧化，羊肉表面疏水性增强，羊肉汁液损失率增加。

天然植物中的次生代谢产物具有广谱抑菌活性，可作为天然防腐剂广泛应用于食品行业。本研究发现，绵羊日粮中添加沙葱及其提取物能够显著降低贮藏期内背最长肌中的细菌总数。有研究表明，酚类化合物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有广谱抑菌活性，其作用机理是酚类化合物能够作用于微生物细胞膜，干扰其蛋白质合成和能量代谢途径。Lu Jun等发现源于中草药中的槲皮素、木犀草素和芦丁等的黄酮类化合物具有显著的抑菌活性，其抑菌机理是黄酮类化合物很容易吸附到微生物细胞膜表面，抑制细胞膜内脱氢酶的活性，扰乱微生物的正常代谢。本实验中，在贮藏期第1～5天细菌总数和乳酸菌数以及第3～7天假单胞菌数趋于稳定，进一步证明了沙葱及其提取物中的活性成分对微生物的生长具有一定的抑制作用。沙葱及其提取物中的活性成分可能与脂肪、蛋白质存在潜在互作效应，导致进入贮藏后期微生物含量显著升高，但最主要原因还是微生物生长。

本研究结果表明，舍饲肉羊日粮中添加沙葱及其提取物能够显著降低背最长肌中3种膻味脂肪酸的沉积量，改善羊肉风味，同时能够减缓羊肉脂肪和蛋白质氧化进程、提高背最长肌抗氧化能力，维持羊肉pH值和肉色，降低汁液损失，抑制细菌生长，从而延长保质期并改善羊肉品质。