没食子酸对人食管癌TE-1细胞的体外抑制作用及其机制

吴昊 努兰·拜都拉 刘琳玉 任艳利

关键词没食子酸;食管癌;凋亡;活性氧;TE-1 细胞

食管癌作为全世界发病率和病死率前10 位的癌症，其治疗情况和患者预后情况均较差[1-2];特别是在中国，食管癌的发病率和病死率分列第4 位和第6 位，均超过世界平均水平的2 倍[3]。根据全球癌症观察站的预测结果，我国男性食管癌新发病例数占比将超过全球新发食管癌病例数的一半[4]。食管癌患者的早期症状并不明显，而当患者出现明显的吞咽梗阻、声音沙哑或淋巴结肿大则提示其病情已进入晚期[5]。目前，食管癌的治疗以手术切除、放化疗为主，其中手术切除常伴随着出血、穿孔、食管狭窄和感染等多种并发症，而放化疗会引发营养不良、骨髓抑制、肝肾功能损害和神经系统毒性等明显的毒副作用[6]。可见，寻找新的治疗方案和新型药物来改善食管癌患者的治疗效果显得尤为重要。

没食子酸（gallic acid，GA）的分子式为C7H6O5，是一种多酚类化合物，通常为白色或淡黄色的针状结晶，易溶于水和乙醇，具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等广泛生理活性[7]。该成分在自然界中分布广泛，是五倍子、大叶桉、红景天等多种传统中药的主要活性成分之一[8]。已有研究表明，GA 能够抑制人肺癌A549 细胞的增殖和迁移，并可通过调节Janus 激酶/信号转导及转录激活因子3（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription3，JAK/STAT3）信号通路及下游凋亡分子来增强顺铂的抗肿瘤作用[9]。另有研究表明，GA能够提高活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，从而可诱导人胶质母细胞瘤细胞、膀胱癌细胞、人乳腺癌细胞以及黑色素瘤细胞的凋亡[10-12]。基于此，本研究拟以人食管癌TE-1 细胞为对象，首先考察GA对细胞增殖、迁移和集落形成能力的影响，其次探究该成分对TE-1 细胞ROS水平的影响，最后根据GA处理后TE-1 细胞内凋亡相关因子B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X 蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）、caspase-9 以及细胞周期蛋白D1（cyclinD1）、cyclin D3 的表达水平来探索GA治疗食管癌的潜在机制，以期为该成分抗肿瘤作用的阐释以及食管癌的治疗提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器包括Multiskan GO型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），Cyto-FLEX 型流式细胞仪（美国Beckman Coulter 公司），Galaxy 170S 型恒温二氧化碳（CO2）细胞培养箱、5430 型低温高速离心机（德国Eppendorf公司），Mini-PROTEANTetra 型蛋白電泳仪和转膜仪、GS-900 型校准型密度计（美国Bio-Rad 公司），Ti-s 型倒置荧光显微镜（日本Nikon 公司），HH-2 型电热恒温水浴锅（上海力辰仪器科技有限公司），BSA124S 型电子天平（德国Sartorius 公司），SX-500 型高压灭菌锅[天美（中国）科学仪器有限公司]等。

1.2 主要药品与试剂

GA 对照品（批号63262，纯度≥98%）购自美国MCE公司;胎牛血清、RPMI 1640 培养基、胰蛋白酶（批号分别为RB35941、AF29531042、J180022）均购自美国HyClone 公司;Annexin Ⅴ/PI 细胞凋亡检测试剂盒（批号0315976）购自美国BD公司;MTT试剂（批号0793）购自合肥白鲨生物科技有限公司;磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered solution，PBS，pH7.4，批号69092500）购自北京索莱宝科技有限公司;细胞荧光计数（cell fluorescencecounting kit-F，CCK-F）试剂盒、ROS 荧光探针（DCFH-DA）试剂盒、特超敏ECL化学发光试剂盒（批号分别为122920210601、S0033S、082020201106），兔源Bcl-2、caspase-3、cyclin D1 单克隆抗体（批号分别为090220210406、121520210422、020321210405），鼠源Bax、caspase-9、cyclin D3、β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（ 批号分别为090920210311、090820210407、021219210413、120319201012），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG 二抗（批号分别为020821210409、121020210409），以及RIPA 裂解液等Western blot 相关试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司;二甲基亚砜等其余试剂均购自天津北联试剂厂;水为双蒸水。

1.3 细胞

人食管癌细胞TE-1 购自武汉普诺赛生物科技有限公司，批号为CL-0231。

2 方法

2.1 细胞培养

将人食管癌TE-1 细胞培养于含10%胎牛血清、100u/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基中，于37.5 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养（培养条件下同），取对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2 细胞增殖活性的检测

采用MTT 法进行检测。取对数生长期的TE-1 细胞，调整细胞密度至1×105个/mL，按每孔100 μL接种于96 孔板中，培养过夜，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组（每组设置6 个复孔），并另设空白调零孔（不加细胞和药物，只加培养基）。给药组加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（浓度依据前期预实验结果设置）的培养基（无双抗）100 μL，对照组加入同体积的培养基。分别培养24 h 和48 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT试剂20μL，孵育2 h;弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜200 μL，振荡10 min 使充分溶解，用酶标仪于570 nm 波长下检测吸光度（A）值，通过以下公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（给药组A值-空白调零孔A值）/（对照组A值-空白调零孔A 值）×100%。采用SPSS 26.0 软件计算GA作用不同时间后对细胞的半数抑制浓度（medianinhibitory concentration，IC50）。

2.3 细胞形态和细胞活性的检测

采用CCK-F 法和倒置荧光显微镜进行检测、观察。取对数生长期的TE-1 细胞，调整细胞密度至1×105 个/mL，按每孔100 μL接种于96 孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，每组设置3 个复孔。给药组加入含GA 100、300、500 μmol/L（浓度依据“2.2”项下实验结果设置）的培养基100 μL，对照组加入同体积的培养基。培养24 h 后，采用倒置荧光显微镜观察TE-1 细胞的形态变化;同时，采用CCK-F法检测TE-1 细胞数量变化，按其试剂盒说明书方法进行操作。

2.4 细胞迁移情况的检测

采用划痕实验进行检测。取对数生长期的TE-1 细胞，调整细胞密度至1×106个/mL，按每孔2 mL接种于6孔板中，培养4 h，待细胞基本长满时，使用10 μL白枪头在皿底作笔直的划痕，用PBS 冲洗细胞2 次。将细胞分为给药组和对照组，给药组加入含GA 100、300、500μmol/L（浓度依据“2.2”项下实验结果设置）的培养基1mL，对照组加入同体积的培养基，每组设置3 个复孔。分别于培养0、4、12、24 h 时观察并拍照，用Image J 软件分析划痕面积并按以下公式计算24 h 时的相对划痕愈合率：相对划痕愈合率（%）=（0 h 时划痕面积-培养24h 时划痕面积）/0 h 时划痕面积×100%。

2.5 细胞集落形成的检测

采用平板集落形成实验进行检测。取对数生长期的TE-1 细胞，调整细胞密度至1×103个/mL，按每孔1 mL接种于6 孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，每组设置3 个复孔。弃去培养基，给药组加入含GA 5、10、15、20、25 μmol/L（浓度依据前期预实验结果设置）的培养基2 mL，对照组加入同体积的培养基。培养10 d后，弃去培养基，用PBS冲洗3 次;以10%甲醛溶液室温固定15 min，用PBS冲洗3 次，再以结晶紫染色3 min，用PBS洗去浮色，采用Image J 1.8.0 软件分析集落数量（肉眼可见的集落也计算在内）并按下列公式计算集落形成相对数量：集落形成相对数量（%）=（给药组集落数量/对照组集落数量）×100%。

2.6 细胞凋亡的检测

采用流式细胞术进行检测。取对数生长期的TE-1细胞，调整细胞密度至1×106个/mL，按每孔2 mL接种于6 孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，每组设置3 个复孔。弃去培养基，给药组加入含GA 100、300、500 μmol/L（浓度依据“2.2”项下实验结果设置）的培养基2 mL，对照组加入同体积的培养基。培养24 h 后，收集细胞，加入Annexin Ⅴ-FITC 和PI 染料，室温避光染色15 min，过滤，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.7 細胞内ROS水平的检测

采用DCFH-DA 法进行检测。DCFH-DA 能够自由进入细胞膜并在细胞内被酯酶水解为DCFH，细胞内的ROS能够氧化无荧光的DCFH使其变为有荧光的DCF，检测其荧光强度即可反应ROS水平。取对数生长期的TE-1 细胞，调整细胞密度至1×105个/mL，按每孔100 μL接种于96 孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，每组设置3 个复孔。给药组加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（浓度依据前期预实验结果设置）的培养基100 μL，对照组加入同体积的培养基。培养24 h后，收集细胞，于稀释好的DCFH-DA中吹散，37 ℃避光孵育30min，每隔5 min取出混匀。孵育完成后，用无血清的培养基洗涤细胞2次，利用FITC通道检测各孔的荧光强度，通过ModfitLT 5 软件分析其平均荧光强度，再按以下公式计算ROS水平：ROS水平（%）=给药组的平均荧光强度/对照组的平均荧光强度×100%。

2.8 细胞中caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、cyclinD1、cyclin D3 蛋白表达的检测

采用Western blot 法进行检测。取对数生长期的TE-1 细胞，调整细胞密度至1×105个/mL，按每孔100 μL接种于96 孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，每组设置3 个复孔。给药组加入含GA 100、200、300、400、500 μmol/L（浓度依据前期预实验结果设置）的培养基100 μL，对照组加入同体积的培养基。培养24 h 后，收集细胞，使用RIPA裂解液及苯甲基磺酰氟提取总蛋白，以BCA法检测蛋白浓度，参照最低浓度对所有蛋白浓度进行归一化处理后，在蛋白样品中加入上样缓冲液，沸水浴中放置3 min 使变性。取变性蛋白适量，进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶电压70 V，浓缩胶电压110 V，电泳时间120 min）后，转移至硝酸纤维素膜（电流300 mA;转膜时间根据蛋白大小决定，一般1 kDa 转膜1 min）上;用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别按1 ∶1 000的稀释比例加入各目的蛋白和内参蛋白（β-actin）一抗，4 ℃孵育过夜;用TBST缓冲液洗膜3次，按1 ∶1 000 的稀释比例加入相应二抗，室温孵育2 h;用TBST缓冲液洗膜3次，加入ECL发光液适量，于暗室内曝光，使用Image J 1.8.0软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为目的蛋白的表达水平。

2.9 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。每组实验至少重复3 次。计量资料用x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 GA对细胞存活率的影响

不同浓度（100、200、300、400、500 μmol/L）的GA处理24 h 和48 h 对TE-1 细胞均有明显的抑制作用，且该抑制作用具有一定的浓度和时间依赖趋势。24 h 和48h 时，GA 的IC50 分别为（281.22 ± 26.81）μ mol/L 和（220.90±31.15）μmol/L。结果见图1。

3.2 GA对细胞形态和细胞活性的影响

CCK-F 结果显示，随着GA浓度的增加，TE-1 细胞数量明显减少，且细胞形态发生明显变化;当GA浓度为500 μmol/L 时，TE-1 细胞排列稀疏，细胞体积缩小、变圆，细胞核固缩，染色质凝集。结果见图2。

3.3 GA对细胞迁移的影响

对照组细胞的划痕面积随时间的延长而不断缩小，在24 h 时其相对划痕愈合率可达（62.31±2.41）%。随着GA浓度的增加，各给药组细胞的相对划痕愈合率均显著下降（P<0.01或P<0.05）;当GA浓度为500 μmol/L时，相对划痕愈合率为（6.71±1.33）%，且GA的抑制迁移作用有浓度依赖趋势。结果见图3、图4。

3.4 GA对细胞集落形成的影响

在培养10 d 后，对照组存在大量肉眼可见的细胞集落;与对照组比较，各给药组细胞集落形成相对数量均显著减少（P<0.01 或P<0.05），且有随GA浓度增加而减少的趋势。结果见图5、图6。

3.5 GA对细胞凋亡的影响

当TE-1 细胞经不同浓度（100、300、500 μmol/L）的GA 作用24 h 后，其凋亡率分别为（6.21 ± 0.32）% 、（12.59±0.58）%和（15.41±0.41）%，对照组TE-1 细胞的凋亡率为（5.29±0.28）%。与对照组比较，各给药组细胞的凋亡率均显著升高（P<0.01 或P<0.05），且有随着GA浓度增加而升高的趋势。结果见图7、图8。

3.6 GA对细胞ROS水平的影响

经DCFH-DA染色后，与对照组比较，除100 μmol/L的GA外，其余给药组细胞的荧光强度和ROS水平均显著升高（P<0.01 或P<0.05），且均有随着GA浓度增加而升高的趋势。结果见表1、图9。

3.7 GA 对细胞中Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、cyclin D3 和cyclin D1 蛋白表达的影响

与对照组比较，各给药组细胞中Bcl-2（仅GA 200μmol/L 组）、Bax（GA 100 μmol/L 组除外）、caspase-3、caspase-9（GA 100 μmol/L组除外）的表达水平均显著升高（P<0.01 或P<0.05），Bcl-2（GA 100、200 μmol/L 组除外）、cyclinD1、cyclin D3 蛋白的表达水平均显著降低（P<0.01 或P<0.05），且均有一定的浓度依赖趋势。结果见图10、图11。

4 讨论

在我国，食管癌是较为高发的恶性肿瘤之一，由于其发病位置特殊、诱发因素较多、早期症状不明显、传统手术和化疗药物对患者伤害较大等诸多原因，使得其整体治疗水平尚未令人满意[13]。

ROS 形式多样，如超氧阴离子（O2 -）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（HO·）等。在正常的代谢过程中，机体会不断产生ROS，后者会被一些抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶）和一些具有还原作用的小分子（如维生素C和还原型谷胱甘肽）所消耗，从而维持机体氧化与抗氧化的动态平衡[14]。不同濃度的ROS 对细胞有着不同的作用：高浓度的ROS 会破坏质膜的完整性，影响actin 骨架的动力学稳定性，造成DNA损伤，并导致正常的细胞信号转导机制受损;而低浓度的ROS可能会促进细胞的增殖和分化，并可能会诱导肿瘤发生[15]。有研究指出，与正常组织细胞相比，肿瘤细胞处于较高的氧化还原状态，可通过提高肿瘤细胞的ROS水平来使其先于正常细胞达到ROS的死亡阈值;换言之，肿瘤细胞对ROS的敏感性高于正常细胞。这一特点使ROS 对肿瘤细胞具有一定的选择性杀伤能力[16]。范桂娟[17]的研究也证实，在由白藜芦醇衍生物和Cu（Ⅱ）构建的促氧化体系中，ROS对肝癌细胞HepG2 的毒性显著高于正常细胞L02。

本研究发现，GA能明显抑制食管癌TE-1 细胞的活力，并且呈一定的时间和剂量依赖趋势;划痕实验和集落形成实验结果显示，GA能够显著抑制TE-1细胞的集落形成能力和迁移能力，且其在较低浓度（5～25 μmol/L）就能体现较强的集落形成抑制能力。凋亡检测结果显示，GA处理24 h 能明显提高TE-1 细胞的凋亡水平，且有随着药物浓度增加而升高的趋势。

为了进一步探究GA诱导食管癌TE-1 细胞的凋亡机制，本研究检测了经不同浓度GA处理后细胞中ROS水平的变化，结果显示，随着GA浓度的增加，TE-1 细胞内的ROS水平也随之提高。随后的Western blot 结果显示，与对照组比较，300～500 μmol/L的GA能使抗凋亡蛋白Bcl-2 蛋白的表达水平显著降低，200～500 μmol/L 的GA能使促凋亡蛋白Bax 蛋白的表达水平显著上升;同时，GA能够提高caspase-3、caspase-9 的表达水平，降低cyclin D1、cyclin D3 的表达水平，且有浓度依赖趋势。caspase 家族是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶的全称，其中caspase-9 可与细胞色素、凋亡酶激活因子形成复合物，从而激活caspase-9;激活的caspase-9 可再激活细胞凋亡的关键启动者caspase-3，从而诱导后续的细胞凋亡[18]。cyclin D1 和cyclin D3 均为cyclin 家族成员，其主要作用是对细胞周期进行正调控，促进细胞增殖，其中cyclin D1 是细胞进入G1期的关键蛋白，其表达上调会导致G1/S 期检测点失效，从而造成细胞越过此检测点而直接进入S 期，允许未经修复的突变DNA进行复制，最终增加癌症发生的风险[19]。cyclin D1 和cyclin D3 在不同组织中有着明显的表达差异，Yu 等[20]研究发现，cyclinD1 的过量表达和胃癌的病理程度没有明显的相关性，但cyclin D3 的表达却与胃癌恶性程度存在明显关联。

综上所述，GA能够抑制TE-1 细胞的增殖、迁移和集落形成，其机制可能是通过提高食管癌TE-1 细胞内ROS 的产生水平来启动凋亡，并通过上调Bax、caspase-3、caspase-9 的表达和下调Bcl-2、cyclin D1、cyclinD3 的表达来实现凋亡。本研究结果为阐明GA抑制食管癌的作用机制提供了一定的理论基础，然而将GA作为抗食管癌的特效药物并应用于临床，还需要大量深入研究以完善其具体的作用机制。