赤红球菌甲苯胁迫响应蛋白基因的克隆、生物信息学分析和表达变化研究

张 帆,袁 媛,曾 艳,付 薇,彭 仁

(江西师范大学生命科学学院,江西 南昌 330022)

0 引言

随着化妆品、医药、塑料、电子等领域的快速发展，排放的有机溶剂越来越多，对环境的污染逐渐加重，对人的健康以及其他生物的正常生长都有严重的负面影响.若男性长期在含有甲苯、苯等有机溶剂的环境中生活,则患前列腺癌的风险就会显著增加[1];人们长期饮用被苯酚污染的水就会引起头晕、贫血、神经系统疾病甚至癌症等[2].

红球菌属于放线菌目，是介于分枝杆菌(Mycobacterium)和诺卡氏菌(Nocardia)之间的一类好氧、G+C含量高的革兰氏阳性菌.一般来说，红球菌属可划分为4个或6个分支[3],其中一些菌株含有多种水解酶、合成酶，在生物降解、生物催化、生物合成等领域中具有广泛的应用价值[4-7].如赤红球菌能够降解苯酚、四氢呋喃、萘等,合成丙烯酰胺,产红色素,且具有一定的有机溶剂耐受性[5-13].

通常有机溶剂等一些有机化合物对微生物会产生毒害，然而微生物能够对这些有机化合物的胁迫做出响应，抵抗它们的毒害作用.常见的响应机制包括利用细胞内代谢来降解和转化有机溶剂；通过上调分子伴侣的表达来协助蛋白的正确折叠；通过外排泵将有机化合物及时排出细胞外；降低细胞膜的流动性和表面疏水性；降低细胞比表面积；加强外膜囊泡的外排作用[14].

本实验室已分离得到赤红球菌SD3(R.ruberSD3)菌株，该菌株可降解一些有机污染物，并在生物修复领域中具有应用价值[15].此外,本实验室还进行了赤红球菌SD3的定量蛋白质组学研究，组学研究结果表明:在甲苯胁迫下，有一个功能未表征的蛋白上调倍数最高，达到3.34倍[13],该蛋白被命名为甲苯胁迫响应蛋白1(Tsrp1).为了进一步研究Tsrp1,本文对tsrp1基因进行TA克隆,然后对Tsrp1蛋白进行了生物信息学分析.此外,利用qPCR比较了tsrp1基因在甲苯和苯酚胁迫下的表达变化情况,以期为赤红球菌的有机溶剂胁迫响应机制解析以及Tsrp1的功能研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

R.ruberSD3保存于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2012035.

1.2 方法

1.2.1R.ruberSD3基因组DNA的提取 挑取R.ruberSD3单菌落至50 mL LB液体培养基中，于35 ℃、180 r·min-1条件下震荡培养48～60 h,即得R.ruberSD3 种子液.取1 mLR.ruberSD3种子液接种至50 mL LB液体培养基中,于35 ℃、180 r·min-1条件下震荡培养至OD600 nm值为1.0,即得培养液.利用TIANamp bacteria DNA Kit(购自Tiangen公司)从R.ruberSD3培养液中提取基因组DNA.提取后的基因组DNA通过1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定.

1.2.3 赤红球菌Tsrp1的生物信息学分析 根据核酸序列，得到Tsrp1的蛋白质序列.通过ProtParam在线网站(https://web.expasy.org/protparam/)对Tsrp1的基本理化性质进行分析;利用SignalP-5.0 Server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测Tsrp1蛋白是否存在信号肽;使用PredictProtein软件(https://www.predictprotein.org/)预测Tsrp1序列中二硫键的位置；利用PSORT软件(http://psort1.hgc.jp/form.html)进行Tsrp1蛋白的亚细胞定位分析.通过TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测在Tsrp1中是否存在跨膜区域；采用NCBI中的Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)分析在Tsrp1 中含有何种保守结构域[15];使用Clustal Omega进行多序列比对[16];登录psipred在线网站(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/),预测Tsrp1的2级结构[17];通过I-TASSER在线网站(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)预测Tsrp1的3级结构[18].利用Autodock软件将Tsrp1蛋白与c-di-GMP进行分子对接[19].

1.2.4R.ruberSD3在甲苯和苯酚胁迫下tsrp1基因的表达变化 向50 mL LB液体培养基中加入1 mL种子液，同时分别加入体积分数为0.2%的甲苯及质量分数为0.08%的苯酚.在35 ℃、200 r·min-1的恒温摇床中培养24 h，离心收集菌体.

采用硅基质吸附柱法从菌体中抽提RNA.采用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(cDNA一链合成试剂盒)对提取的RNA进行逆转录，反应体系见表1,反应条件为25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃下处理5 min使酶失活.

表1 逆转录反应体系

R.ruberSD3在甲苯和苯酚胁迫下tsrp1基因的表达变化用荧光定量 PCR进行分析.荧光定量 PCR 体系为2×SYBR Green Mix 5 μL 、正向引物和反向引物各加 0.5 μL、 cDNA 2 μL,最后用ddH2O定容至10 μL.荧光定量PCR程序为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,反应40个循环.用于qPCR 的引物序列如表2所示.所有样品重复3次,qPCR结果采用2-△△CT法[20]进行分析.

表2 用于qPCR的引物序列

2 结果与分析

2.1 在R. ruber SD3中tsrp1基因的克隆

提取后的R.ruberSD3基因组DNA如图1所示，条带大小相符.在TA克隆过程中获得的阳性克隆进行菌液PCR鉴定，结果如图2所示.由图2可知:条带位于250～500 bp之间，与tsrp1基因的大小相符.

注:M为D2000 DNA Marker,1为赤红球菌SD3基因组DNA.图1 赤红球菌SD3基因组DNA

注:M为D2000 DNA Marker,1～3为菌液PCR鉴定.图2 阳性克隆的菌液PCR鉴定

将转化成功的阳性克隆在37 ℃振荡培养后,根据质粒小量抽提试剂盒(购自Solarbio公司)步骤提取重组质粒，用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行酶切鉴定，结果如图3所示.由图3可知:在酶切后出现2个条带，其中一个条带接近2 000 bp,与pESI-T质粒的大小(1 865 bp)相符.另一个条带在250～500 bp之间，与tsrp1基因的大小(417 bp)相符.

注:M为D2000 DNA Marker,1为双酶切鉴定.图3 阳性克隆的双酶切鉴定

将阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得tsrp1基因序列.将该基因序列提交GenBank,登录号为MK371001.

2.2 Tsrp1蛋白的生物信息学分析

根据tsrp1基因序列确定Tsrp1蛋白质序列.Tsrp1蛋白由138个氨基酸残基组成，分子式为C611H1007N171O214S1,理论分子量为14.2 kDa,理论等电点为4.82.带负电荷残基总数(Asp+Glu)有19个，带正电荷残基总数(Arg+Lys) 有15个.该蛋白半衰期相对较长，在酵母细胞中大于20 h，在大肠杆菌中大于10 h.经计算，该蛋白不稳定系数(the instability index (II))为18.68(<40)，由此推测Tsrp1蛋白稳定性较强.对Tsrp1蛋白进行亲/疏水性分析，结果表明该蛋白总平均疏水指数(grand average of hydropathicity,GRAVY)为-0.154，这表明Tsrp1蛋白亲水性较强.在ProtScale网站上进行进一步分析，结果如图4所示.在68位谷氨酸处得分最低(-1.256)，在第95位亮氨酸处得分最高(0.978).

图4 Tsrp1蛋白的亲/疏水性分析

Tsrp1蛋白没有二硫键和信号肽，也没有跨膜区.亚细胞定位分析表明Tsrp1蛋白存在于细胞质中.NCBI 的Conserved Domain预测结果表明Tsrp1蛋白没有保守结构域.

在NCBI中搜索与R.ruberSD3中Tsrp1序列相似的蛋白，然后进行多序列比对，比对结果如图5所示.在R.ruberSD3中Tsrp1蛋白与R.rhodochrous、R.zopfii、R.pyridinivorans、R.hoagii、M.brevis、C.manganitolerans中的序列相似蛋白的相似性分别为94.93%、71.29%、67.96%、44.58%、42.05%、35.00%，并且在这7种蛋白质中有14个氨基酸残基位点完全相同.

对Tsrp1蛋白二级结构进行预测(见图6),该蛋白二级结构主要是α-螺旋，占比为81.85%.利用I-TASSER在线建模工具预测得到Tsrp1蛋白的3级结构模型如图7所示.该蛋白的2级结构和3级结构模型为功能研究奠定基础.

图6 Tsrp1蛋白的2级结构预测

图7 Tsrp1蛋白的3级结构预测

注:R. rhodochrous、R. zopfii、R. pyridinivorans、R. hoagii、M. brevis、C. manganitolerans的Tsrp1序列相似的蛋白在NCBI中的序列号分别为OOL29969、WP_072813063、WP_019289712、NKZ90064、WP_066906770、WP_153505852.

对Tsrp1蛋白及c-di-GMP小分子进行能量优化、加氢、加力场，根据计算机模拟空腔位点的算法，分子对接模拟结果如图8所示.对接结果打分表明-CDOCKER_ENERGY为2.031 4，-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY为44.235 4.这说明小分子化合物能够与蛋白较好地结合.从图9可以看出:c-di-GMP小分子能够与Tsrp1蛋白中的氨基酸残基Thr 15、Asp 18、Ala 44、Thr 45、Gln 99形成稳定的分子间氢键作用力，结合较为牢固；它还能够与Tsrp1蛋白中的氨基酸残基Val 12、Ala 41、Ala 44、Ala 48、Ala 51、Tyr 88、Val 92、Leu 96形成共轭作用力，共同维持2者之间的结合稳定性.

(a)整体图 (b)细节图图8 c-di-GMP对接Tsrp1的3维模式整体图

图9 c-di-GMP对接Tsrp1的2维模式图

2.3 R. ruber SD3中tsrp1基因在甲苯和苯酚胁迫下的表达

为了探明tsrp1与R.ruberSD3有机溶剂耐受性之间的关系，本文利用荧光定量PCR方法研究了在甲苯和苯酚胁迫下R.ruberSD3中tsrp1基因表达变化情况.

图10表明:与野生型对照组相比，在体积分数为0.2%的甲苯胁迫下tsrp1基因的mRNA 相对表达量为原来的40.19倍(P<0.01)，在质量分数为0.08%的苯酚胁迫下tsrp1基因的mRNA相对表达量为原来的14.73倍(P<0.001).这说明Tsrp1蛋白与R.ruberSD3对于甲苯和苯酚的胁迫响应之间存在密切联系.

注:**表示P<0.01，***表示P<0.001.图10 在甲苯和苯酚胁迫下R. ruber SD3 中tsrp1基因的表达变化情况

3 讨论

近年来，人们越来越重视有机溶剂引起的环境污染问题,对于这类污染物质的治理方法通常有物理法、化学法和生物法.物理法通常是采用吸附、萃取等物理作用来去除污染物质，而化学法是通过催化作用来消除或降低污染物质的毒害作用.生物法相对于物理法和化学法来说具有经济、耗能少、处理效率高、处理量大、无2次污染等优点，是目前在污染治理中应用较为广泛的处理技术之一.迄今为止，国内外科研工作者筛选得到了一些能够降解有机溶剂的微生物，其中包括P.putidaKF715[21]、P.fluorescensS613[22]、R.equi[23]、R.rhodochrousRPK1[24]、厌氧反硝化菌群[25]等.当微生物在处理有机溶剂时，就会引起胁迫响应，造成一些基因表达的变化.如S. Basak等[26]发现在有机溶剂胁迫下，大肠杆菌突变体的manXYZ 膜保护基因表达上调，但具体机制有待解析.Fan Xin等[27]报道赤红球菌SD3在甲苯和苯酚胁迫下，DnaK 的表达分别上调了29.87倍和3.93倍.当R.anatipestiferRA-GD菌株暴露在有机溶剂中时,一种ABC外排泵——RIA_1614——也会发生显著上调[28].笔者发现:赤红球菌SD3在苯酚和甲苯胁迫下，tsrp1基因表达量发生显著上调.然而Tsrp1是一种没有保守结构域的蛋白质，在NCBI和Uniprot数据库中均未阐述它的生物学功能.本文通过研究分子对接发现Tsrp1与c-di-GMP存在相互作用.c-di-GMP是在细菌中普遍存在的第二信使，能够调节一系列细胞功能，包括生物膜形成、运动性、毒性和其他多种生理过程.c-di-GMP与效应蛋白或核糖开关结合可以调节细菌的多种生理活动[29].因此,笔者认为Tsrp1可能作为c-di-GMP的效应蛋白在赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性方面发挥作用.