一种测定右旋糖酐原料含量的方法研究

王光娥

(广西南宁市桃源兽药厂,南宁 530104)

右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌L.-M-1226(Leuconostocmesenteroides)发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，经处理精制而得[1]。是一种血容量补充药，也是生产右旋糖酐铁的一种主要原料，目前收载的原料品种有右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70等，《中国药典》[2]和《中国兽药典》[1]均未收载相关右旋糖酐原料的含量测定方法，右旋糖酐原料除分子量与分子量分布系数要符合规定之外，其糖酐含量也是影响右旋糖酐原料质量的一个重要因素，目前国内文献尚未见右旋糖酐原料含量检测的相关报道。只有《英国药典》收载的右旋糖酐铁注射液[3]项下有右旋糖酐含量的检测。参照《英国药典》收载的右旋糖酐铁注射液项下右旋糖酐含量的检测方法，采用的是蒽酮-硫酸比色法，利用紫外可见分光光度计进行检测。文献中有蒽酮-硫酸比色法测定多糖的研究[4]-[10]，其原理是将多糖氧化成葡萄糖[4]，而右旋糖酐是一种高分子葡萄糖聚合物，可利用D-无水葡萄糖作为对照品，建立标准曲线，求曲线方程，用线性方程式计算供试品中葡萄糖含量，并将结果与0.94相乘[3]而得出右旋糖酐的含量。利用蒽酮-硫酸比色法对右旋糖酐含量检测进行了相关实验研究，建立了较为准确、可靠的一种右旋糖酐原料的含量检测方法，已申请发明专利，并获得了受理通知书。为右旋糖酐铁生产企业严把原料质量关提供了一项可行的质量控制方法，为修订右旋糖酐原料的国家标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司SP-1920)；数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司HH-4)。

1.2 试剂与材料 国家药品标准物质D-无水葡萄糖化学对照品(中国食品药品检定研究院110833-201707，含量99.9%)；浓硫酸(重庆万盛川东化工有限公司20190101)；蒽酮(上海五联化工厂出品);右旋糖酐20样品(四川新开元制药有限公司、山东金洋药业有限公司等)。

1.3 试验方法 取右旋糖酐原料0.2 g，精密称定，置500 mL量瓶中，加水振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀；精密量取3 mL于试管中，放入冰水中冷却至0 ℃。加入6 mL预冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混匀，立刻将试管浸入沸腾的水浴锅中加热12分钟，取出，冷却后在625 nm[3]下测吸光度。另精密称取D-无水葡萄糖对照品约20 mg，加水稀释至50 mL，摇匀后，再分别精密量取0、1、2、3、4 mL稀释至25 mL，然后各取3 mL于试管中，自“放入冰水中冷却至0 ℃”起同法操作，以葡萄糖浓度与吸光度来建立线性方程。用线性方程式计算供试品中葡萄糖含量，并将结果与0.94相乘[3]，即得供试品中右旋糖酐含量。

1.4 检测波长的确认 精密称取D-无水葡萄糖对照品与糖酐20样品，分别加水稀释，使对照品与样品的浓度均在0.04 mg/mL左右，摇匀。分别精密量取3 mL于试管中，放入冰水中冷却至0 ℃。加入6 mL预冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混匀，立刻将试管浸入沸腾的水浴锅中加热12分钟，取出，冷却后，在500 nm～700 nm波长范围内[3]进行光谱扫描，确定最大吸收值的测定波长。

1.5 线性范围与相关系数 精密称取D-无水葡萄糖对照品约20 mg，加水稀释至50 mL，摇匀后，再分别精密量取0、1、2、3、4 mL加水稀释至25 mL。然后各取3 mL于试管中，放入冰水中冷却至0 ℃。加入6 mL预冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混匀，立刻将试管浸入沸腾的水浴锅中加热12 min，取出，冷却后，在625 nm下测定吸光度。按对照品的取样量、含量、稀释倍数计算出各对照品的浓度值(mg/mL)，从低浓度到高浓度依次检测，以浓度为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求线性方程和相关系数。

1.6 样品含量测定 精密称取右旋糖酐20约0.2 g，加水稀释至500 mL，按1.3项方法操作，在625 nm处测定吸收值，代入线性方程，计算出葡萄糖含量，并将结果与0.94相乘[3]，即得供试品中右旋糖酐含量。

1.7 加样回收实验 精密称取已知右旋糖酐含量的样品四份，各平行做三份样品，加水溶解再取各平行样下溶液，加已知浓度的D-无水葡萄糖对照品溶液进行回收率试验：精确称取右旋糖酐20原料约0.2 g，用水稀释至500 mL，取此溶液10 mL再稀释至100 mL。另取此溶液10 mL，分别加入上述定容至50 mL(0.4016 mg/mL)的D-无水葡萄糖对照品溶液1、2、4、6 mL，再加水稀释至100 mL。各取3 mL稀释后的溶液于试管中，放入冰水中冷却至0 ℃。分别加入6 mL预冷至0 ℃的0.2% W/V蒽酮硫酸溶液混匀，立刻将试管浸入沸腾的水浴锅中加热12 min，取出，冷却后在625 nm[3]下测吸光度，另用3 mL水代替稀释后的药液重复测定，做空白对照。加入对照品溶液的浓度即按对照品的取样量、含量、稀释倍数计算出来的各浓度值(mg/mL)，样品的浓度为实际测得的浓度值，并取三份平行样的平均值和加入对照品的量来求回收率与回收率的批间RSD值。

1.8 重复性实验 取不同生产企业生产的右旋糖酐20原料共六批次，各批次做2 份平行样，依1.3试验方法进行检测，求相对偏差。

1.9 稳定性实验 取供试溶液在冷却后检测，在分别放置0.5、1、1.5、2.0 h时，再次取供试液进行上机检测，验证供试溶液放置时间的稳定性。

2 结果与分析

2.1 检测波长 精密取D-无水葡萄糖对照品(110833-201707，含量99.9%)0.0011 g，加水稀释至25 mL(即0.044 mg/mL)，摇匀；精密称取糖酐20样品约0.0043 g，加水稀释至100 mL(即约0.043 mg/mL)，摇匀。依法处理样品，在500 nm-700 nm波长范围内进行光谱扫描，结果对照品和样品均在625±1 nm内有最大吸收，与英国标准用的波长一致，故确认检测波长为625 nm。见图1、图2。

图1 对照品的光谱曲线图Fig 1 Spectral curve of reference substance

图2 样品的光谱曲线图Fig 2 Spectral curve of the sample

2.2 标准曲线 浓度在0.0161-0.0642 mg/mL范围内，在625 nm处检测，测定的吸光度与浓度呈线性相关，其线性方程为A=14.15C+0.0009，相关系数r=0.9997。

检测结果见表1。

表1 D-无水葡萄糖对照品溶液各不同浓度测得的吸光度Tab 1 Absorbance measured at different concentrations of D-anhydrous glucose reference solution

将以上数据以D-无水葡萄糖浓度为X轴，吸光度为Y轴进行回归分析，其回归曲线，见图3.

图3 D-无水葡萄糖对照品的标准曲线图Fig 3 Standard curve of D-anhydrous glucose reference

2.3 样品含量测定 取样品(右旋糖酐20原料)约0.2 g三份，精密称定，按1.6项方法操作，样品含量为97.2%(RSD=0.08%)。结果见表2.

表2 样品检测结果Tab 2 Sample test results

2.4 回收率实验 取已知右旋糖酐含量(97.2%)的原料样品，加入D-无水葡萄糖对照品溶液，即浓度分别为0.0040 mg/mL，0.0080 mg/mL，0.0161 mg/mL，0.0241 mg/mL，按1.7项下方法操作，将测得的浓度与已知浓度(原料+对照品)用XLS工作表计算相应回收率，其结果在100.1%～100.9%，平均回收率为100.5%，回收率的批间RSD值为0.35%。检测结果见表3。

表3 加样回收试验结果Tab 3 Experimental results of sample addition and recycling

以在样品中添加的对照品浓度(单位为mg/mL)为X轴；以实际测得的浓度(单位为mg/mL)为Y轴进行回归分析，其回归曲线见图4。

图4 样品中添加对照品浓度与实际测得的浓度回收曲线图Fig 4 Recovery curve of the concentration of standard substance added to the sample and the actual measured concentration

2.5 重复性实验 各样品检测结果的相对偏差在0.04%～0.31%，均小于0.5%，符合《兽药检验操作规范》[12]要求，证明检测结果可靠，其含量均在95%以上。测试结果见表4。

表4 样品重复性试验结果Tab 4 Sample repeatability test results

2.6 稳定性实验 溶液放置2 h后含量下降约0.7%，测试溶液基本稳定，但建议冷却后及时测定。测试结果见表5。

表5 稳定性试验结果Tab 5 Stability test results

3 讨论与结论

3.1 0.2% W/V蒽酮硫酸溶液的配制 蒽酮试剂见光易分解,所用试剂最好现用现配。先将硫酸与水混匀(硫酸∶水=19∶1 v/v)放入冰浴中冷却，再将称好的蒽酮加入，搅拌使溶解完全即可。否则，容易出现颜色偏深现象或者放置时间略长，颜色明显加深。

3.2 沸水浴方法的选择 因用分光光度法测定，随着沸水浴时间的延长，测定液颜色会随之加深，直接影响最终检测结果。假如按每个样都加热至沸腾后开始计时，容易造成人为因素引起误差。直接设置水浴锅为100 ℃，保持沸腾状态，从放入试管即开始计时到取出为止，检测结果平行性好，精密度高。

3.3 沸水浴时间的选择 分别选择了5、10、12、15 min进行对照实验，结果平均回收率为 87.9%、92.83%、100.5%、103.7%。故选择了沸水浴时间为12 min，平行性好，回收率最接近100%。

3.4 适用性 因右旋糖酐20、右旋糖酐40、右旋糖酐70只是重均分子量的不同，均系蔗糖经肠膜状明串珠菌L.-M-1226号菌(Leuconostocmesenteroides)发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物，经处理精制而得。故对各种右旋糖酐原料的含量检测均适用。

3.5 质量控制指标 因使用不同供应商生产的右旋糖酐原料生产出来的右旋糖酐铁产品存在质量差异。经抽取不同厂家提供的不同批次的右旋糖酐样品进行含量检测发现，有的含量在85%左右，有的含量达98%以上。而使用含量高的右旋糖酐原料生产出来的产品质量会更好。故认为糖酐含量也是影响右旋糖酐原料质量的一个重要因素。目前右旋糖酐的质量标准方法项下尚无糖酐含量的检测项，为了进一步提高右旋糖酐铁的产品质量，企业可增加右旋糖酐原料的糖酐含量检测项，严把原料质量关，建议控制右旋糖酐原料含量在95%以上。

试验参照了《英国药典》收载的右旋糖酐铁注射液项下的糖酐含量检测方法，在其基础上进行了步骤细化和实验条件改进，并用在了右旋糖酐原料的含量检测上，线性良好，回收率高，精密度高，具有创新性，可用于右旋糖酐原料的质量控制。