一株表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒的构建及其复制稳定性分析

杨明珠，陈晓春，张 媛，王秀丽，李俊平

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

猪伪狂犬病是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的急性传染病，对养猪业危害巨大，主要造成仔猪腹泻、发热、呼吸症状、神经症状、衰竭死亡，生长猪呼吸困难、生长停滞，母猪不育、流产、死亡胎、木乃伊胎，康复猪可能存在潜伏感染，当康复猪免疫低下，会存在排毒的风险[1]。2011年以来，伪狂犬病病毒变异株在我国暴发流行并不断蔓延全国[2]，研究发现其致病力显著增强，传统疫苗Bartha-K61株不能提供完全的保护，迫切需要研制出针对变异株的新型疫苗。同时，随着分子生物学技术的发展，关于伪狂犬病的分子生物学研究取得了很大进展。PRV含有多个复制非必需区，容纳外源基因的能力强，其中有些基因与病毒的毒力有关而不参与病毒的复制[3]，若通过基因工程技术将PRV的毒力基因失活或者缺失，或者将外源基因插入到PRV基因组中构建重组病毒，不仅保持了原病毒的良好抗原性，还可以同时预防重组蛋白相关疫病，起到了一针多防的效果，大大提高生产效率，对多种病毒的防控具有重要意义。本研究在实验室前期对PRV研究的基础上将绿色荧光蛋白标记基因插入到PRV基因组的UL4-UL3基因间区域，构建了能够稳定表达增强型绿色荧光蛋白(Enhance green fluorescent protein，EGFP)的重组伪狂犬病毒，并对其稳定性、体外增殖特性进行了研究，为下一步构建重组伪狂犬活载体疫苗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 毒株与细胞 PRV-SX株为中国兽医药品监察所在2012年于山西某猪场分离得到的一株高致病性流行毒株；rPRV-bc-8，是以PRV-SX株为基础构建的TK基因突变、US8与US9基因缺失的弱毒株。PK15细胞由中国兽医药品监察所保存。

1.1.2 载体及质粒 质粒pMD-US6+7-EGFP-US2由实验室自行制备保存；pESAY-Blunt Simple Cliong kit购自北京全式金生物技术有限公司。全基因合成质粒pUC-polyA-UL3订购于北京六合华大基因科技股份有限公司。

1.1.3 主要试剂 Top10感受态细胞、质粒小提试剂盒、质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自康宁生命科学有限公司；快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Ⅱ型购自北京百泰克生物技术有限公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶SbfI、AflII购自NEB(北京)有限公司；Kod one购自东洋纺(上海)有限公司

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GeneBank上的PRV序列，自行设计合成系列扩增及鉴定用引物(表1)，用于扩增左右同源臂以及鉴定重组病毒。

表1 同源臂扩增及鉴定用引物Tab 1 Primers for homology arm amplification and identification

1.2.2 转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3的构建 利用Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒提取PRV-SX株基因组，以其为模板用引物rPUL4F/rPUL4R扩增左同源臂UL4基因，连接pEASY-Blunt Zero克隆载体，构建pEASY-Blunt-UL4，测序正确后小提质粒备用。将质粒pMD-US6+7-EGFP-US2与质粒pEASY-Blunt-UL4分别 经SbfI/AflII双酶切，回收目的片段后用T4连接酶连接，获得转移质粒pMD-UL4-EGFP-US2，再将质粒PMD-UL4-EGFP-US2与质粒pUC-polyA-UL3经SpeI/EcoR I双酶切，回收相应片段后经T4连接酶连接，获得转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3(图1)，提取高浓度无内毒素质粒，以备转染。

图1 转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3的构建示意图Fig 1 Schematic diagram of the construction of the transfer plasmid pMD-UL4-EGFP-UL3

1.2.3 重组病毒的获得 准备一个铺有PK-15细胞的24孔板，在细胞密度达90%左右时，取rPRV-bc-8病毒液1 μL与2 μL转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3，利用脂质体法共转染细胞，待细胞病变达80%以上后于-80 ℃及室温下冻融两次收毒。将转染后收集的病毒液接种于铺有单层PK-15细胞的六孔板中，吸附1 h，弃去吸附液，每孔加入3 mL含有1%琼脂与5%FBS的培养液，待培养液凝固后倒置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养。接种24 h后在倒置荧光显微镜下观察，挑选单个荧光蚀斑于0.5 mL DMEM培养液中，震荡混匀后继续接种于长至单层的PK-15细胞，如此纯化4次后获得纯化病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。

1.2.4 重组病毒的鉴定 将纯化获得的重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3利用DNA/RNA提取试剂盒提取其基因组，用引物PUL3F/PUL3R2进行PCR鉴定，同时将野毒株PRV-SX株、亲本株rPRV-bc-8利用相同的引物扩增，比较扩增结果。

1.2.5 体外增殖实验 将PRV-SX株、rPRV-bc-8以及rPRV-UL4-EGFP -UL3分别按0.1 MOI接种PK-15细胞，分别在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染细胞，并分别测定TCID50，比较三种毒株在不同培养时间下的滴度并绘制增殖曲线。

1.2.6 重组病毒的遗传稳定性 将重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在PK-15细胞上连续传20代，分别提取重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第5、10、15、20代重组病毒的DNA，按步骤1.2.4的方法进行PCR鉴定。取重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第20代重组病毒进行荧光蚀斑观察。

1.2.7 荧光蛋白浓度的测定 将亲本株rPRV-bc-8、重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3分别按0.1 MOI接种PK-15细胞，分别在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染细胞，离心取上清后通过分子荧光光谱仪进行荧光蛋白浓度的测定并绘制曲线。

2 结果与分析

2.1 转移质粒的构建 质粒pEASY-Blunt-UL4经SbfI/AflII双酶切，切出997 bp和3956 bp两个片段(图2)，与预期大小一致，经测序确定结果与理论序列一致，表明质粒pEASY-Blunt-UL4构建成功；pMD-UL4-EGFP-US2经SbfI/AflII双酶切，得到大小约为997 bp和5261 bp的两个片段(图3)，与预期大小一致，经测序确定结果与理论序列一致，表明质粒pMD-UL4-EGFP-US2构建成功。质粒pMD-UL4-EGFP-UL3经SpeI/EcoR I双酶切得到大小约为1166 bp和5226 bp的两个片段(图4)，与预期大小一致，经测序确定结果与理论序列一致，表明质粒pMD-UL4-EGFP-UL3构建成功。

M: BM2000 DNA Marker；1：质粒pMD-UL4-EGFP-UL3图2 pEASY-Blunt-UL4的Sbf I/Afl II双酶切产物Fig 2 The double enzyme digestion results of pEASY-Blunt-UL4

M: BM2000 DNA Marker；1：质粒pMD-UL4-EGFP-US2图3 pMD-UL4-EGFP-US2的Sbf I/Afl II双酶切产物Fig 3 The double enzyme digestion results of pMD-UL4-EGFP-US2

M: BM2000 DNA Marker；1：质粒pMD-UL4-EGFP-UL3图4 pMD-UL4-EGFP-UL3的Spe I/ EcoR I双酶切产物Fig 4 The double enzyme digestion results ofpMD-UL4-EGFP-UL3

2.2 重组病毒的纯化 将转染所收的病毒液接种于铺有单层PK-15细胞的六孔板，培养24 h后在倒置荧光显微镜下便能观察到绿色荧光(图5)，初步判断重组毒构建成功。挑选单个荧光蚀斑于0.5 mL DMEM培养液中，震荡混匀后继续接种于长至单层的PK-15细胞，如此纯化4次后获得纯化病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3(图6)。

图5 培养24 h后产生的绿色荧光(10×10)Fig 5 Green fluorescence after 24 h incubation(10×10)

图6 纯化得到的重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3Fig 6 Purified recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3

2.3 重组病毒的鉴定 取200 μL重组病毒液利用DNA/RNA提取试剂盒提取其基因组，利用引物PUL3F/PUL3R2进行PCR鉴定，结果显示rPRV-UL4-EGFP-UL3扩增得到大小约为1710 bp的条带，野毒株PRV-SX与亲本毒rPRV-bc-8分别用相同的引物扩增得到同样的大小约为374 bp的条带(图7)。经测序证明重组病毒基因组序列正确。

M: BM2000 DNA Marker；1：rPRV-UL4-EGFP-UL3；2：PRV-SX；3：rPRV-bc-8；4：Negative control图7 重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3的PCR扩增鉴定电泳图Fig 7 Identification of recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 by PCR

2.4 重组病毒的生长特性分析

2.4.1 体外增殖实验 将rPRV-bc-8以及rPRV-UL4-EGFP-UL3分别按0.1MOI接种PK-15细胞，分别在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染细胞，并分别测定TCID50，比较两种毒株在不同培养时间下的滴度并绘制增殖曲线(图8)。结果表明重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快，接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8，接种后40 h达到最高滴度108.3TCID50/mL，但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒，亲本毒rPRV-bc-8于32 h达到最高滴度108.4TCID50/mL。重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3的病毒滴度平台期较短，到达平台后滴度下降的比亲本毒快。

图8 重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8感染PK15细胞的一步生长曲线Fig 8 One-step growth curve of recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 and parental virus rPRV-bc-8 infecting PK15 cells

2.4.2 重组病毒的遗传稳定性 将重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在PK-15细胞上连续传20代，分别提取第5、10、15、20代重组病毒的DNA，以其为模板用引物PUL3F/PUL3R2进行PCR扩增鉴定，结果均扩增得到大小约为1710 bp的目的条带(图9)。取重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第20代重组病毒进行荧光 蚀斑观察，结果显示重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3以及第20代重组病毒蚀斑大小相近，荧光亮度相似(图10)，表明重组病毒能够稳定遗传。

2.4.3 荧光蛋白浓度的测定 将亲本株rPRV-bc-8、重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3分别按0.1MOI接种PK-15细胞，分别在12、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96 h收集感染细胞，离心取上清后通过分子荧光光谱仪进行荧光蛋白浓度的测定并绘制曲线(图11)。结果表明重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内表达EGFP蛋白的水平在感染细胞56 h后达到最高，荧光蛋白浓度达4793.9 ng/mL，之后进入蛋白表达平台期。

M:BM5000+ DNA Marker；1：rPRV-UL4-EGFP-UL3；2:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P5);3:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P10);4:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P15);5:rPRV-UL4-EGFP-UL3(P20);6：PRV-SX；7：rPRV-bc-8；8：Negative control图9 重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3各代次PCR扩增鉴定电泳图Fig 9 Identification of several generation of recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 by PCR

图10 第20代重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3感染PK15细胞Fig 10 The 20th generation recombinant virus rPRV-UL4-EGFP-UL3 infects PK15 cells

图11 绿色荧光蛋白浓度测定结果图Fig 11 Graph of green fluorescent protein concentration measurement results

3 讨 论

猪伪狂犬病是危害我国养猪业的重要疫病，其弱毒疫苗自使用以来免疫保护效果良好且应用广泛，是理想的重组病毒载体。近年来，随着对PRV分子生物学研究的深入，其作为重组病毒表达载体的类型越来越丰富，单毒力基因缺失及多毒力基因共缺失株的构建为疫苗株的安全性提供了保障，同时通过对PRV基因组上复制非必需区进行深入研究，可供外源基因插入的大量位点也逐渐被发掘，并通过多种成熟的重组技术，如传统同源重组技术、构建PRV BAC、构建PRV Fosmid文库以及CRISPR/Cas9基因编辑技术等，实现了将多种猪的重大疫病病毒抗原基因作为外源基因成功插入到PRV的非必需区，如将非洲猪瘟病毒的CD2V蛋白基因插入TK基因区域[4],将猪流行性腹泻病毒S蛋白基因和猪轮状病毒VP7 蛋白基因插入到gE基因区域[5]，将猪圆环病毒2型的Cap蛋白基因插入PK-gG基因之间[6]、UL22-UL24基因之间[7]、US4-US6基因之间[8-9]，将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因插入到gG基因区域[10]等。

目前还没有研究显示PRV基因组上的UL4-UL3基因之间的区域是否可以作为外源基因插入位点，但在同属疱疹病毒火鸡疱疹病毒的重组活载体疫苗研究中常将UL4-UL3基因之间的区域作为外源基因的插入位点，并且外源基因在此位点具有良好的表达效果[11]。因此本实验选取PRV基因缺失株rPRV-bc-8基因组上的UL4-UL3基因之间的区域作为外源基因插入位点，利用同源重组技术成功构建了表达EGFP基因的重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。病毒传至20代，经鉴定及测序显示基因位置插入正确且无突变；对绿色荧光表达情况的观察说明EGFP基因能够成功表达；重组病毒在PK15细胞中的生长曲线表示重组病毒所达到的最高滴度与亲本毒无差异，说明外源基因的插入对重组病毒的增殖影响不大；对重组病毒的外源蛋白表达量进行了测定显示该位点可以有效进行外源基因的表达。因此将PRV基因缺失株rPRV-bc-8基因组上的UL4-UL3基因间区域作为外源基因插入的位点在理论以及实践中是可行的，为下一步相关重组伪狂犬病毒的研发应用奠定了基础。