QuEChERS-超高效液相色谱-质谱联用法测定熊胆粉中9种苯二类药物残留量

王小乔，许晓辉*，张虹艳，冯 翀, 2，吴福祥，潘秀丽，李 赟

(1.兰州市食品药品检验检测研究院，兰州 730050；2.兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州 730050)

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1290 UPLC/6460C超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子源(美国安捷伦科技有限公司)；Vortex-genie2涡旋混合器(美国Scientific)；H1850离心机(湖南湘仪)；MS105DU分析天平(梅特勒-托利多)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；SBL-10DT超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司，功率为300 W)；GENO2010组织研磨仪(美国SPEX)。

1.2 试剂 甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸、乙酸铵(色谱纯，东京化成工业株式会社)； EMR-Lipid dSPE 净化管(美国安捷伦科技有限公司)；硫酸钠、氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。对照品：马来酸咪达唑仑(批号：171250-201002；纯度：99.9%)、艾司唑仑(批号：171219-201003；纯度：99.7%)、奥沙西泮(批号：171229-201505；纯度：99.8%)、硝西泮(批号：171217-201403；纯度：99.9%)、劳拉西泮(批号：171253-201102；纯度：99.2%)、阿普唑仑(批号：171218-201305；纯度：99.5%)、氯硝西泮(批号：171227-201404；纯度：99.9%)、三唑仑(批号：171230-201203；纯度：99.6%)、地西泮(批号：171225-200903；纯度：99.9%)均购自中国食品药品检定研究院；熊胆粉样品购自中药材市场。

1.3 溶液制备

1.3.1 EDTA-Mcllvaine缓冲液 称取柠檬酸8.4 g，Na2EDTA 19.5 g，磷酸氢二钠7.1 g，溶于650 mL水中，超声溶解。

1.3.3 供试品溶液的制备 提取：取熊胆粉样品适量，研细，混匀；精密称取熊胆粉约1 g置于50 mL离心管中，加入3 mL EDTA-Mcllvaine缓冲液，加入1粒陶瓷均质子，振荡摇匀，再加入乙腈10.00 mL，在组织研磨仪上振荡涡旋5 min，在300 W功率下超声提取5 min，加入含4 g 硫酸钠和1 g 氯化钠的萃取盐包，再涡旋2 min，在4 ℃下以4000 r/min速率离心15 min，取上清液待净化。

净化：精密移取上述上清液2.00 mL于EMR-Lipid dSPE净化管中，涡旋1 min，在4 ℃下以4000 r/min离心15 min，取上清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-质谱联用仪测定。

1.4 色谱-质谱条件

1.4.1 色谱条件 ACQUITY BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1×100 mm)；流动相：以含0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸铵的水溶液为流动相A，以含0.1%甲酸的乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱程序：0～3.0 min，10%～30%B；3.0～5.0 min，30%～90%B；5.0～7.0 min，90%B；7.0～8.0 min，90%～10%B；8.0～9.0 min，10%B。柱温：35 ℃；进样量： 2 μL；流速：0.3 mL/min；分析时间：9 min。

1.4.2 质谱条件 电离源：喷射流电喷雾离子源(AJS ESI)；离子源模式：正离子模式；采集方式：多反应监测模式(MRM)；干燥气：N2；干燥气流量：8 L/min；干燥气温度：325 ℃；雾化气压力：45 psi；毛细管电压：4000 V；鞘流气流量：12 L/min；鞘流气温度：350 ℃，相关质谱采集参数见表1。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

2.1.1 提取溶剂的选择 本实验分别选择甲醇、乙腈、乙酸乙酯为提取溶剂，以相同水平浓度的9种目标分析物加标对应回收率为依据，按照1.3.3和1.4项下条件进行前处理和上机分析，考察提取溶剂的提取效果。结果表明，以甲醇为提取溶剂时，回收率处于15%～56%之间，且大多数目标分析物的回收率小于40%；以乙酸乙酯为提取溶剂时，回收率处于51%～180%之间，且除硝西泮之外，其余目标分析物回收率普遍偏高；以乙腈为提取溶剂时，目标分析物的回收率整体较好，这可能是乙腈对目标分析物具有较好的溶解性，同时能很好地沉淀蛋白质，去除杂质比较充分，整体上降低了基质的干扰(图1)。因此，最终选择乙腈为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对9种苯二类药物提取效率的影响Fig 1 Influence of different extraction solvents on theextraction efficiency of nine benzodiazepine drugs

2.1.2 净化方法的选择 由于熊胆粉样品基质中含有较多熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸及少量脂肪和蛋白质，这些类别的杂质会在提取过程中进入提取液，在分析目标化合物时会产生基质效应，对检测结果造成干扰，这些杂质大部分是脂溶性的，因此需要采用高脂类净化方式来除杂，而增强型脂质去除分散固相萃取净化管(EMR-Lipid dSPE)是专门为多脂样品中脂质性杂质的选择性净化而设计，因此，本实验选择EMR-Lipid dSPE方式进行净化。

2.2 色谱质谱条件优化

表1 9种苯二类药物检测离子对及相关参数Tab 1 Ion pairs and related parameters for nine benzodiazepine drugs

2.3 基质效应 本实验通过取空白样品，按照前处理方法制备成空白样品基质溶液，再分别用空白样品基质溶液与纯溶剂配制成相同浓度的对照品溶液，以两者同一药物质谱响应值比值的百分数来评价基质效应(Matrix Effect，ME)，若ME大于100%，则存在基质增强效应；若ME小于100%，则存在基质抑制效应；若ME接近100%，则不存在基质效应，本实验设计了两个浓度级别10 ng/mL和30 ng/mL，结果发现，9种化合物在10 ng/mL的条件下，除劳拉西泮存在基质效应增强效应外，其余分析物存在一定程度的基质抑制效应，其中基质抑制效应最强的是咪达唑仑和硝西泮；在30 ng/mL的浓度下，艾司唑仑、奥沙西泮、阿普唑仑存在一定程度的基质增强效应，其余待测物存在不同程度的基质抑制效应。虽然各待测物存在不同程度的基质效应，但不影响检测结果(图2)。

图2 9种苯二类药物的基质效应Fig 2 Matrix effect of nine benzodiazepine drugs

表2 9种苯二类药物的线性关系、检出限和定量限Tab 2 Linear relationship, LOD and LOQ of nine benzodiazepine drugs

2.5 回收率及相对标准偏差考察 取空白样品，分别按10、50、100 μg/kg 添加3个水平的混合对照品溶液，考察方法的回收率和日间、日内相对标准偏差(RSD)。每个添加水平制备平行样6份，在1.3.3项和1.4项条件下进行前处理和上机分析，计算相应的回收率与相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，结果显示，在3个加标水平下，9种目标分析物的加标平均回收率为69.1%～108.0%，日内RSD为1.8%～9.0%，日间RSD为2.6%～9.3%(表3)。

表3 9种苯二类药物的平均回收率与相对标准偏差(n=6)Tab 3 Average recovery and RSD of nine benzodiazepine drugs(n=6)

3 讨论与结论