长链非编码RNA 膀胱癌相关转录本1、癌症易感性候选物9在恶性胸腔积液中的表达及诊断价值Δ

谢诗琪，石志浩，陈萍，李坚

江苏大学附属医院呼吸与危重症医学科，江苏 镇江 212001

胸腔积液是由多种不同原因引起的胸膜疾病[1]，胸腔积液的病因诊断仍然是临床医师需面临的一大挑战[2]。根据病因胸腔积液可分为良性胸腔积液和恶性胸腔积液。恶性胸腔积液多来源于恶性肿瘤的胸膜转移，仅少数是由于原发性胸膜肿瘤（恶性胸膜间皮瘤）所致，是渗出性胸腔积液第二大常见病因，胸腔积液多是晚期或转移性恶性肿瘤的标志，多提示患者预后不良[3]。原发性肺癌是引起恶性胸腔积液最常见的原因，占所有恶性胸腔积液的50%以上，其次是乳腺癌（16.8%）和恶性淋巴瘤（11.5%）[4-6]。临床和影像学表现可对胸腔积液病因诊断提供辅助信息，但不能作为确诊依据。胸腔积液或胸膜组织标本检出肿瘤细胞是诊断恶性胸腔积液的金标准，但胸腔穿刺胸腔积液脱落细胞检测的阳性率尚不能令人满意[7]，尽管胸腔镜胸膜活检对恶性胸腔积液的确诊率超过90%[7-8]，但由于该操作为有创性检查且对技术要求较高使其临床使用受到一定局限。良恶性胸腔积液在治疗方案及预后评估方面迥然不同，因此，早期鉴别诊断尤为重要。随着近年来无创分子诊断技术的迅速发展，为临床通过检测胸腔积液标本中的肿瘤特异性分子标志物来诊断恶性胸腔积液提供了更多的选择[9-10]。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类非编码转录本，通常并不编码蛋白质，其长度超过200 个核苷酸，参与调控肿瘤的发生发展过程，并在肿瘤的发生发展过程中常异常表达，lncRNA 能进入血液、胸腔积液等体液中稳定存在，可作为恶性肿瘤诊断和预后评估的生物标志物[11-13]。lncRNA 膀胱癌相关转录本1（bladder cancer-associated transcript 1，BLACAT1）在多种肿瘤患者的肿瘤组织和血清中表达明显上调，有望成为诊断某些肿瘤的生物标志物[14]。lncRNA 癌症易感性候选物9（cancer susceptibility candidate 9，CASC9）被认为可能成为部分肿瘤的治疗靶点、诊断及预测预后的生物标志物，有可能用于部分肿瘤的诊断和治疗过程中[15-16]。研究证实，临床多采用多项肿瘤标志物联合检测来提高恶性肿瘤的诊断效能[17]，但目前关于BLACAT1 和CASC9 作为生物标志物在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的价值尚未见报道。因此，本研究选取良恶性胸腔积液患者为研究对象，应用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法检测胸腔积液中BLACAT1 和CASC9 的表达水平，并与经典的肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和细胞角质蛋白19 片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）进行比较，探讨上述肿瘤标志物在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年7 月至2021 年7 月江苏大学附属医院收治的初治胸腔积液患者。纳入标准：①恶性胸腔积液患者的原发肿瘤均经病理学检查确诊，包括纤维支气管镜活检、胃镜活检、经胸腔穿刺肺活检及区域淋巴结穿刺活检；②恶性胸腔积液的性质最终经细胞学或组织病理学检查确定，如胸腔积液脱落细胞学检查及胸膜活检；③良性胸腔积液的病因均通过综合临床表现、体征、实验室检查及影像学检查进行诊断。排除标准：①接受过正规抗肿瘤治疗；②严重肝肾功能不全；③多器官功能衰竭；④严重出血、凝血功能障碍；⑤认知水平低下或存在严重精神障碍。依据纳入和排除标准，本研究共纳入96 例胸腔积液患者，其中良、恶性胸腔积液患者各48 例。良性胸腔积液患者中男30 例，女18 例；年龄18～85 岁，平均（66.04±15.51）岁；疾病类型：结核性胸腔积液14 例，肺炎旁胸腔积液17 例，心功能不全6 例，低蛋白血症3例，脓胸2 例，自发性液气胸6 例。恶性胸腔积液患 者 中 男32 例，女16 例；年 龄33～94 岁，平 均（67.94±11.71）岁；疾病类型：肺癌46 例[肺腺癌43例，肺鳞状细胞癌2 例，小细胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）1 例]，食管癌1 例，乳腺癌1 例。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

血浆总RNA 提取Trizol 试剂、互补DNA（complementary DNA，cDNA）逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR 试剂盒均购自宝日医生物技术（北京）有限公司，提取RNA 过程中使用的氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC 水均购自国药集团化学试剂有限公司。QuantStudio®5 实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胸腔积液标本采集和处理 通过胸腔穿刺术收集所有患者胸腔积液标本200 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，30 min 内完成以下处理步骤：1060 r/min、4 ℃离心5 min，离心半径为10 cm；弃上清留取沉淀，向沉淀中加入红细胞裂解剂吹打混匀，静置5 min，以520 r/min、4 ℃离心5 min，离心半径为10 cm，如遇沉淀中血红素含量较多时，该步骤可重复1 次；弃去上清液，加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）吹打混匀洗涤沉淀，以1060 r/min、4 ℃离心5 min，离心半径为10 cm，同时根据情况可重复该步骤洗涤沉淀；最终留取沉淀加入1 ml的Trizol 液吹打混匀，转移至新的离心管中，-80 ℃保存备用。另外留取10 ml胸腔积液标本采用酶联免疫吸附试验检测CEA、CYFRA21-1 水平，CEA的 正 常 值 参 考 范 围 为0～5 ng/ml，CYFRA21-1 的正常值参考范围为0.21～7.00 ng/ml。

1.3.2 胸腔积液RNA 的提取及逆转录cDNA 的合成 将冻存标本室温解冻，取500 μl 加入100 μl氯仿振荡混匀后静置5 min，采用低温高速离心机12 275 r/min、4 ℃离心15 min，取200 μl 上层水相，加入等量异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min；然后12 275 r/min、4 ℃离心10 min，可见底部微量白色沉淀，弃上清液加入500 μl 75%乙醇上下混匀清洗沉淀，以7970 r/min、4 ℃离心5 min，留取沉淀，于室温下干燥5～10 min 至无色透明，溶于适量DEPC 水，测定RNA 浓度及纯度，-80 ℃保存备用。根据逆转录试剂盒说明书，于冰上配置20 μl 逆转录反应体系，逆转录条件为37 ℃5 s，85 ℃15 min，4 ℃随机，合成cDNA 放置于-20 ℃保存备用。

1.3.3 实时荧光定量PCR 法检测胸腔积液中BLACAT1、CASC9 的 相 对 表 达 量 取2 μl 的cDNA 作为引物模板，于冰上配置20 μl 反应体系，PCR 反应条件：95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、60 ℃退火和延伸5 s，共40 个循环。每个样本设置3 个复孔，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，采用2-ΔΔCT法计算BLACAT1、CASC9 的相对表达量。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对所有数据进行统计分析，采用Kolmogorov-Smirnov 检验对所有数据进行正态性检验，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，计算曲线下面积（area under the curve，AUC），评估CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 单独及联合检测对恶性胸腔积液的诊断效能，两个及以上的肿瘤标志物联合检测对恶性胸腔积液诊断效能的评估采用逐步Logistic 回归分析方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BLACAT1、CASC9 相对表达量的比较

恶性胸腔积液中BLACAT1、CASC9 的相对表达量均明显高于良性胸腔积液，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表2 良恶性胸腔积液中BLACAT1、CASC9 相对表达量的比较[M（P25，P75）]

2.2 不同临床特征肿瘤患者恶性胸腔积液中BLACAT1、CASC9 相对表达量的比较

不同年龄、性别、吸烟情况、病理类型及有无糖尿病或心血管疾病肿瘤患者恶性胸腔积液中BLACAT1 相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同性别、吸烟情况、病理类型及有无糖尿病或心血管疾病肿瘤患者恶性胸腔积液中CASC9 相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；年龄＞65 岁肿瘤患者恶性胸腔积液中CASC9 的相对表达量高于年龄≤65 岁患者，差异有统计学意义（Z=-2.204，P=0.028）。（表3）

表3 48例不同临床特征肿瘤患者恶性胸腔积液中BLACAT1、CASC9的相对表达量

2.3 CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 单独及联合检测对恶性胸腔积液的诊断效能

CEA 单独检测诊断恶性胸腔积液的AUC为0.918（95%CI：0.863～0.974），高 于BLACAT1、CASC9、CYFRA21-1 单独检测，此时的灵敏度、特异度分别为87.2%、81.2%。BLACAT1+CASC9+CEA 联合检测诊断恶性胸腔积液的AUC 为0.938（95%CI：0.888～0.989），高于BLACAT1+CASC9、BLACAT1+CASC9+CYFRA21-1 联合检测的AUC，此时的灵敏度、特异度分别为91.5%、81.2%。（图1、表4）

表4 CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 单独及联合检测对恶性胸腔积液的诊断效能

图1 BLACAT1、CASC9、CEA和CYFRA21-1单独及联合诊断恶性胸腔积液的ROC曲线

3 讨论

恶性胸腔积液是肿瘤患者的常见并发症，约15%的肿瘤患者疾病进展过程中会出现恶性胸腔积液[3]，其中10%以胸腔积液症状为首发表现，常预示着肿瘤已进展至晚期[18]。胸腔积液或胸膜组织标本检出肿瘤细胞或肿瘤组织即可确诊恶性胸腔积液，但一项前瞻性研究显示，胸腔穿刺胸腔积液脱落细胞学检测对恶性胸腔积液阳性检出率为46%[7]，闭式胸膜活检通常并不能进一步提高恶性胸腔积液的阳性检出率[3,19]。近年来，肿瘤生物标志物在肿瘤诊断中的应用价值逐渐引起临床的重视[20]，胸腔积液中高灵敏度、高特异度的肿瘤标志物检测阳性可以尽早提示胸腔积液的恶性性质，有助于早确诊、早处理以改善患者的预后。

BLACAT1基因定位于人类染色体1q32.1，发挥致癌基因的作用，在多种类型的肿瘤组织中异常表达，能够通过各种机制促使肿瘤的恶性进展[21]。研究发现，BLACAT1 在包括肺腺癌、乳腺癌及食管癌等12 种肿瘤患者血清中的表达情况与肿瘤组织相似，BLACAT1 在这12 种肿瘤患者的血清及肿瘤组织中的表达水平均明显高于对照组，血清BLACAT1 对这些肿瘤的诊断效能较高[14]。Xu 等[22]研究显示，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中BLACAT1 高表达患者的总生存期和无进展生存期均明显短于低表达患者；体外实验证实，BLACAT1 高表达促进了NSCLC 细胞的生长、迁移、转移及上皮-间充质转化。一项Meta分析显示，BLACAT1 在肿瘤组织中的表达水平可作为肺癌、食管癌等多种肿瘤患者预后的生物标志物，BLACAT1 高表达与患者较短的生存期、较低的组织学分级、较晚的临床分期及淋巴结转移有关[23]。Chen 等[24]的 研 究 发 现，BLACAT1 在SCLC组织和细胞中的表达均明显上调，其表达水平与肿瘤临床分期、淋巴结转移、远处转移及预后不良密切相关。另有研究发现，BLACAT1 在阿法替尼耐药NSCLC 细胞中表达上调，下调BLACAT1 的表达可通过调节信号转导与转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信号通路逆转NSCLC细胞对阿法替尼的耐药性[25]。上述研究均证实，BLACAT1 可作为多种肿瘤诊断和预后评估的生物标志物，并可能作为某些肿瘤的治疗靶点。本研究结果显示，BLACAT1 在恶性胸腔积液（大多数来源于肺癌的胸膜转移）中的相对表达量明显高于良性胸腔积液，提示胸膜上转移的肿瘤细胞产生的BLACAT1 释放到了胸腔积液中，从而使检测胸腔积液BLACAT1 作为诊断恶性胸腔积液的生物标志物成为可能，ROC 曲线结果显示，BLACAT1 诊断恶性胸腔积液的灵敏度、特异度和准确度均较高，具有良好的诊断效能。

有研究最早在食管鳞状细胞癌中检测到了CASC9 高表达，随后又在多种恶性肿瘤中检测到CASC9 的表达异常升高，被证实CASC9具有原癌基因的作用[26]。Zhao 等[27]的研究结果显示，CASC9在NSCLC 组织和细胞系中表达上调，CASC9 高表达NSCLC 患者的总生存期明显短于CASC9 低表达患者；体外实验证实，CASC9 可通过调控miRNA-335-3p/S100A14 信号通路促进NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭。有研究显示，CASC9 在NSCLC 组织中高表达，ROC 曲线分析结果表明，CASC9 诊 断NSCLC 的AUC 为0.734（95%CI：0.669～0.799），提示其可能作为诊断NSCLC 的潜在标志物；进一步分析结果表明，CASC9 高表达与NSCLC 患者的病理类型、TNM 分期、预后密切相关[28]。本研究结果显示，CASC9 在恶性胸腔积液中的相对表达量明显高于良性胸腔积液；ROC 曲线分析结果显示，CASC9诊断恶性胸腔积液的灵敏度、特异度均较高，具有良好的诊断效能，与申燕[28]的研究结果一致。

研究表明，多项肿瘤标志物联合检测能提高恶性胸腔积液的诊断效能[29]，本研究结果也证明了这一点。BLACAT1+CASC9 联合检测诊断恶性胸腔积液的AUC 高于二者单独检测，同时灵敏度、准确度均较高。BLACAT1+CASC9 与CEA 联合检测进一步提高了恶性胸腔积液的诊断效能，虽然包括lncRNA 在内的肿瘤标志物不是诊断恶性胸腔积液的金标准，但胸腔积液中异常升高的肿瘤标志物则高度提示恶性胸腔积液可能，有助于临床医师进一步深入检查以尽早获取细胞学或组织学证据。

综上所述，BLACAT1、CASC9 在恶性胸腔积液中表达明显上调，对恶性胸腔积液具有较好的诊断效能，BLACAT1+CASC9 与CEA 联合检测能够进一步提高诊断效能。