运动诱导的miR-126对糖尿病小鼠心肌的保护作用及机制研究

2022-07-01于晓涵

中国体育科技 2022年6期

柳华，孙静，于晓涵，杨翼

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是在糖尿病患者中存在的一类异常心脏结构和功能的心肌病变，其最主要的病理改变表现为心肌微血管管腔变窄，心肌发生缺血缺氧，造成心肌退行变性和广泛小灶性坏死，最终导致心功能减退、各种心律失常和心衰，甚至是心源性死亡。数据显示，65岁以上糖尿病患者的死亡人数中约有70%死于心脏并发症，是非糖尿病患者心脏病死亡率的2～4倍（Benjamin et al.，2019）。DCM是一种严重的糖尿病心脏病并发症，是引起心源性病变和死亡率的重要原因之一。因此，延缓DCM发展对预防糖尿病心源性死亡有重要意义。

运动干预不仅可以有效控制血糖，还能增加最大摄氧量，提高左心室射血分数、心排血量和左室舒张功能（Rodrigues et al.，2012），与心血管疾病死亡率之间呈反比关系（Sluik et al.，2012）。美国糖尿病学会倡导运动作为糖尿病心脏病并发症患者的一种非药物干预方式，但是目前运动改善DCM的机制还不清楚。本研究通过对糖尿病db/db小鼠进行小、中、大强度的运动干预，观察血压（blood pressure，BP）、心率（heart rate，HR）、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、心肌肥大面积、心肌血管密度等指标，检测血清cmiR-126和心肌m-miR-126表达量以及心肌核转录因子kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、Sprouty相关EVH1域含蛋白1（recombinant human sprouty-related EVH1，SPRED1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白表达量，以探讨 miR-126/NF-κB 和miR-126/SPRED1/VEGF通路在运动保护糖尿病心肌中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

16周龄雄性db/db小鼠24只，m/m小鼠6只（购自江苏卡文斯公司，合格证号：No.32002200000166）。饲养于武汉体育学院动物实验中心SPF级实验动物房，分笼饲养。实验期间自由进食和饮水。

1.2 主要仪器设备与试剂

透射电镜（日本HITACHI）、全自动酶标仪Multiskan MK3（赛默飞世尔科技公司）、无创血压仪BP-2010A（北京软隆生物技术有限公司）、正置荧光显微镜（日本尼康）、垂直电泳槽及电转仪（北京六一仪器厂）、实时荧光定量PCR仪QuantStudio6（ABI）、Nano-100微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）、ZS-PT小动物实验跑台（北京众实迪创科技发展有限公司）。

PCR试剂购于TIANGEN和VAZYME公司，DHE染液（SIGMA），主要抗体包括 α-SMA（CST）、SPRED1（SANTA GRUZ）、NF-κB（CST）、GAPDH（CST）、VEGF（SANTA GRUZ），二抗购于CST等。

1.3 实验分组

在实验进行前，所有小鼠均适应性喂养1周，db/db小鼠随机分为4组，每组6只。分别为：空白对照组（NC组），小强度运动组（LE组），中强度运动组（ME组），大强度运动组（HE组）。另取同周龄m/m小鼠对照组（sham组，6只）。

1.4 实验方案

Sham组和NC组不进行干预，正常喂养。LE组、ME组和HE组在平台跑步机上进行8周跑台运动。每周训练5次，每天 1次，每次30 min，训练时间为20：00－21：00，周四和周日休息。运动强度分别为：LE组5 m/min（Liu et al.，2018），ME 组 10 m/min（Veeranki et al.，2016），HE组 15 m/min（Lee et al.，2011），坡度均为0。正式干预之前，由5 m/min运动强度开始进行一周强度递增适应性跑台运动。

1.5 动物取材

最后一次运动后24 h，取血清和心肌组织。取材前禁食不禁水12 h，测BP、HR和FBG；眼眶取血，分离血清，酶联免疫分析ELISA试剂盒检测血清FINS水平；取心肌组织，用于电镜、染色、PCR和Western Blot检测。电镜标本用生理盐水冲洗后，固定于电镜固定液中，其余石蜡包埋和置于液氮中冻存。

1.6 测量BP和HR

采用尾部袖带容积描记测压法。小鼠用塑料通气管道固定于加热袋，测量血压的传感器套在小鼠尾部，通过系统自动充起和放气对其尾动脉进行血流信号的检测，得出收缩压（systolic blood pressure，SBP）、舒张压（diastolic blood pressure，DBP）和HR。

1.7 检测FBG和FINS

测血糖之前禁食10 h，每2周定点检测，小鼠尾静脉取血，使用罗氏血糖测试仪及相配套试纸测小鼠FBG。运动8周后，眼眶取血，室温静置30 min后，4℃离心机3 000 r/min离心10 min，分离血清，采用ELISA试剂盒测定FINS的浓度。

1.8 冰冻切片DHE荧光染色

新鲜组织冰冻切片复温，DHE在避光条件下37℃孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，DAPI室温避光染核10 min，PBS洗涤3次后封片拍照。

1.9 WGA-AF488染色

石蜡切片脱蜡至水后WGA染液染色，避光恒温箱37℃孵育30 min。DAPI染液，避光室温孵育10 min。PBS洗涤3次后封片切片于拍照。

1.10 α-SMA染色

石蜡切片脱蜡至水，组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（pH 9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。加α-SMA一抗，于湿盒内4℃孵育过夜，洗涤3次，每次5 min。加二抗，避光室温孵育50 min。DAPI室温避光染核10 min，PBS洗涤3次后封片拍照。

1.11 实时荧光定量PCR

取血清和心肌组织测量血清miR-126（c-miR-126）和心肌 miR-126（m-miR-126）表达量。Trizol法提取总RNA，用微量分光光度计测定总RNA的纯度和浓度。将RNA逆转录成cDNA，反应条件：25℃5 min，50℃15 min，85℃ 5 min，4 ℃ 10 min。Mmu-miR-216 Loop primer（5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACCGCATTAT-3’）。用荧光定量PCR仪扩增cDNA和检测，反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃30 s，60℃ 30 s，40 cycles。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。

1.12 Western Blot

将心肌组织剪碎后，RAPI裂解匀浆，提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取100 μl蛋白与2×Loading buffer上样缓冲液100 μl混匀后。100℃恒温加热器加热10 min，冷却后-20℃冰箱保存备用。制备10%分离胶和12%浓缩胶。常规上样、电泳、转膜，转膜条件350 mA下，90～120 min。用5%的脱脂奶粉对膜进行封闭，室温缓慢摇荡1～2 h。TBST洗涤。兔抗和鼠抗分别用5%的脱脂牛奶稀释（1∶2 000），4℃冰箱过夜。TBST洗涤后加入用5%BSA稀释的二抗（1∶500），室温缓慢摇荡2 h。TBST洗膜后进行ECL显影、曝光。Image J 11.0软件进行条带灰度值分析。内参为GAPDH。

1.13 统计学分析

使用SPSS 22.0统计软件进行分析处理，数据用平均值±标准差表示（M±SD）。组间差异比较采用单因素方差分析，以P＜0.05作为具有显著性差异，P＜0.01具有非常显著性差异。

2 研究结果

2.1 8周有氧运动后小鼠BP、HR、FBG水平和FINS水平的变化

NC组小鼠SBP和DBP在8周时均显著高于sham组（P＜0.01），LE组、ME组和HE组小鼠跑台训练8周后SBP和 DBP均显著低于 NC组（P＜0.05或P＜0.01，图1A）。

图1 8周有氧运动后小鼠血压、心率、空腹血糖水平和空腹血清胰岛素水平的变化Figure 1.Variations of BP，HR，FBG Level and FINS Level in Mice after 8 Weeks ofAerobic Endurance Exercise

NC组小鼠安静心率8周时均显著高于sham组（P＜0.01）。8周运动干预后LE组、ME组和HE组安静HR显著低于NC组（P＜0.01，图1B）。

NC组FBG在8周时显著高于sham组（P＜0.01）。8周运动干预后，LE组、ME组和HE组FBG显著低于NC组（P＜0.01，图1C）。8周后，NC组的血清FINS显著高于sham组（P＜0.01）；LE组、ME组和HE组显著低于NC组（P＜0.05或P＜0.01，图1D）。

2.2 8周有氧运动后电镜观察结果

NC组心肌细胞线粒体肿胀变性明显且排列紊乱，体积增大，空泡变性，大部分嵴出现融合、断裂的改变，表明糖尿病小鼠心肌细胞受损。LE、ME和HE组运动后心肌组织出现不同程度的改变，其中ME组改善明显，可见心肌细胞的纤维结构基本恢复正常且排列有规律，线粒体轻度肿胀，嵴形态基本正常（图2A）。

图2 8周有氧运动后小鼠心肌组织电镜、DHE染色、WGA-AF488染色和α-SMA染色结果Figure 2.Results of Electron Microscopy，and DHE，WGA-AF488 and Alpha-SMA Fluorescence Staining in Myocardial Tissue of Mice after 8 Weeks of Aerobic Endurance Exercise

2.3 8周有氧运动后心肌组织DHE染色结果

NC组ROS荧光强度显著高于sham组（P＜0.01）；LE组和ME组显著低于NC组（P＜0.01，图2B，图2E）。表明糖尿病小鼠心肌ROS产生增多，8周运动干预后的LE、ME组db/db小鼠中ROS产生较低。

2.4 8周有氧运动后心肌组织WGA-AF488染色结果

NC组小鼠心肌细胞面积显著高于sham组（P＜0.01），8周训练后各运动组心肌细胞平均面积显著低于NC组（P＜0.01，图2C，图2F）。实验表明，WGA-AF488染色发现db/db小鼠心肌肥大，8周有氧运动干预后得到了明显改善。

2.5 8周有氧运动后心肌组织α-SMA染色结果

NC组心肌血管密度显著低于sham组（P＜0.01），各运动组心肌血管密度显著高于NC组（P＜0.05或P＜0.01，图2C，图2G）。表明8周有氧运动有助于心肌血管的生成。

2.6 8周有氧运动后血清和心肌组织中c-miR-126和m-miR-126表达量的变化

8周后NC组c-miR-126和m-miR-126表达量显著低于sham组（P＜0.01），LE组、ME组和HE组血清miR-126和心肌miR-126表达量显著高于NC组（P＜0.01，图3A、图3B）。说明db/db小鼠的循环和心肌miR-126表达下调，8 周有氧运动可以显著上调循环和心肌miR-126表达。

图3 8周有氧运动后小鼠血清和心肌c-miR-126和m-miR-126及心肌中NF-κB、SPRED1和VEGF蛋白表达量的变化Figure 3.Expression levels of c-miR-126 and m-miR-126 in Serum and Myocardium，and NF-κB，SPRED1 and VEGF in Myocardium of Mice after 8 Weeks of Aerobic Endurance Exercise

2.7 8周有氧运动后心肌中NF-κB、SPRED1和VEGF蛋白

结果显示，8周运动干预后NC组NF-κB蛋白表达量显著高于sham组（P＜0.01），LE组、ME组NF-κB蛋白表达的灰度值显著低于NC组（P＜0.05或P＜0.01，图3C、图3D）。说明运动可减轻心肌的炎性反应。NC组SPRED1蛋白表达的灰度值显著高于sham组（P＜0.01），VEGF蛋白表达的灰度值显著低于sham组（P＜0.01），而8周运动干预后ME组SPRED1蛋白表达的灰度值显著低于NC组（P＜0.01），LE组、ME组和HE组VEGF蛋白表达的灰度值显著高于NC组（P＜0.01，图3C、图3E、图3F）。说明中等强度的运动显著提高SPRED1和VEGF蛋白表达量。

3 讨论与分析

3.1 运动改善糖尿病小鼠的BP、HR、FBG和FINS

在糖尿病患者中，约有80%患者患有高血压，而血压和心率升高可显著增加与糖尿病相关的心血管疾病的风险（Fritz et al.，2006；Hillis et al.，2012）。本研究发现，db/db小鼠的血压明显高于m/m小鼠。长期运动可以降低db/db小鼠的舒张压和收缩压。虽然DCM可独立于高血压症状发病，但是有氧运动对血管内皮功能的调节和微循环的改善，可使心脏负荷降低，延缓DCM的发展。长期有规律的运动可使心脏总体积指数提高，增加心脏容量、心室壁厚度以及副交感神经系统的活性，降低静息心率（Collier et al.，2008）。本实验结果表明，长期运动能明显降低糖尿病小鼠心率水平。

高血糖是导致2型糖尿病患者造成血管损伤的原因之一。实验发现，db/db模型小鼠FBG和FINS明显升高，而8周有氧耐力运动干预明显下降各运动组的血糖和胰岛素水平。控制血糖和高胰岛素对调节心率有重要作用，可以减少心血管事件及微血管并发症发生发展。Samuelsson等（2006）发现，对大鼠进行7周的胰岛素处理形成高胰岛素后，左心室质量和心室壁相对厚度增加，心排血量和每搏输出量减少，心肌细胞肥大。本实验发现小强度运动组的血清FINS水平降低不明显，通过长期中等或大强度运动更为明显。同时还发现，WGA-AF488染色显示糖尿病小鼠心肌肥大，8周有氧运动干预的db/db小鼠心肌肥大得到了明显改善。

3.2 运动通过miR-126/NF-κB减少心肌炎症反应

高血糖可引起蛋白质糖基化反应，增加ROS的产生（Luczak et al.，2014），促进心肌炎症和纤维化（Jia et al.，2016）。运动可以改善心脏线粒体代谢，减少线粒体活性氧物质释放（Campos et al.，2017），恢复线粒体功能。实验发现，db/db小鼠心肌组织ROS水平明显增高（图2B）。ROS可进一步激活核因子NF-κB（Shi et al.，2017）。NF-κB是糖尿病心肌病发病的关键细胞因子，调节大量的免疫应答、应激、表面受体、细胞存活和增殖。NF-κB通过炎性反应、氧化应激、内皮功能障碍、细胞凋亡、心肌纤维化等机制参与了糖尿病心肌病的发生发展（Wang et al.，2009）。在本实验中检测了心肌组织中NF-κB的蛋白表达水平，结果显示，db/db小鼠心肌NF-κB表达量明显增加。但是经过8周有氧运动后，小强度、中强度运动组db/db小鼠心肌ROS水平、NF-κB表达量均明显降低，提示，小强度、中强度运动组可减少氧化应激对心肌的炎症刺激，从而减少心肌损伤。

MiRNA是一种长度约为22个核苷酸的非编码RNA，转录后通过mRNA降解或抑制翻译来调节基因表达。MiRNA可以释放到循环系统中，参与各种生理和病理过程。研究发现，miR-126的循环水平在糖尿病及心脏病患者中被下调（Zhang et al.，2015）。本实验有相似结果，与m/m小鼠相比，db/db小鼠循环和心肌miR-126表达量显著下降。而8周的有氧运动使db/db小鼠循环和心肌miR-126的表达量增加，其中以中等强度有氧运动最为明显。

MiR-126通过与多个靶基因作用参与炎症过程。研究发现，miR-126可通过降低靶基因血管内皮细胞粘附分子1的表达，减少白细胞和内皮细胞之间的相互作用，减少炎症反应（Sell et al.，2006）。MiR-126还可以调节趋化因子（CC基序）配体2（CCL2）的表达，参与炎症细胞募集和胰岛素抵抗（Arner et al.，2012）。Feng等（2012）发现，抑制miR-126表达后，可提高靶基因IκBα基因的表达，进而抑制炎症细胞NF-κB的活化。本研究发现，miR-126在运动组心肌中表达量增加，同时ROS水平、NF-κB的表达下降，说明长期有氧运动可能通过miR-126/NF-κB通路减少糖尿病心脏的炎症反应。

3.3 运动通过miR-126/SPRED1/VEGF通路刺激心肌血管再生

MiR-126与血管的再生关系密切。MiR-126的循环水平在患有2型糖尿病及其心脏并发症的患者中被下调（Liu et al.，2014），参与微血管和大血管并发症的发生发展过程（Meng et al.，2012）。Naderi等（2019）研究发现，高血糖降低了糖尿病大鼠心脏miR-126的表达量和血管生成，经过运动以后心肌miR-126的表达量增加。宋伟等（2017）对心梗大鼠进行持续运动和间歇运动8周后发现，间歇运动可以显著促进心脏梗死边缘区血管新生，上调心肌miR-126，改善心功能，与两组均能显著提高miR-126靶基因SPRED1和VEGF基因表达有关。SPRED1蛋白表达上调可能是运动刺激心肌血管再生的机制之一。

目前已明确SPRED1在造血过程具有调节作用。VEGF是血管生成过程中组织生长和器官修复过程中的关键因子。心肌中的VEGF表达上调可显著改善心肌灌注，增加侧支形成，减少缺血事件和改善左心功能（Choi et al.，2006）。SPRED家族蛋白抑制Raf、Ras/ERK激酶，影响VEGF的活性（Park-Windhol et al.，2017）。SPRED1基因是miR-126的靶基因，因此，当miR-126上调可抑制靶基因SPRED1的mRNA表达，解除对Raf、Ras抑制，提高VEGF的表达量。研究发现，在糖尿病患者中内皮细胞释放的内皮微粒miR-126降低，并在体外实验发现SPRED1表达量增加，血管生成和血管完整性缺失，导致内皮功能障碍（Jansen et al.，2013）。本实验α-SMA染色显示与sham组比较，db/db小鼠心肌血管密度下降，8周中等强度有氧运动显著增加心肌血管密度，同时心肌SPRED1表达量下降，促进VEGF的表达。由此可见，中等强度有氧运动可能通过miR-126/SPRED1/VEGF信号通路增加糖尿病心肌血管密度，从而提高供血供氧，保护心肌组织。