蒲参胶囊对心肌梗死动物模型心室重构和心室舒缩功能的影响

朵杰 白洁 韩琼

心室重构是心肌梗死(myocardial infarction，MI)引起的心功能减退的常见原因，心肌组织的损伤和异常增生会直接影响心脏的收缩能力和射血功能[1]。而心脏纤维化则是导致心室重构最主要因素，研究显示MI后会引起氧化应激反应，导致转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表达的身高，进而会激活Smad蛋白，从而调控细胞增殖和分化，并促进心脏纤维化引起心室重构[2,3]。但是目前尚无有效的提高MI后心功能和缓解心室重构的特效药物。蒲参胶囊是一种中药复方制剂，具有改善微循环、保护心肌缺血/再灌注损伤等有益效果[4]。总上，本研究主要分析蒲参胶囊对MI后心室重构和射血功能的影响，并分析其对TGF-β1/Smad通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF级，雄性，8～10周，270～290 g)45只。HP SONOS 5500 型的超声心动图仪(飞利浦公司，美国)。蒲参胶囊(Z20040074，苏中药业，中国)。HE染色试剂盒购自武汉华美公司(中国)。显微镜(Olympus 公司，日本)。ELISA染色试剂盒(碧云天公司，中国)。酶标仪(Model 680，Bio-Rad，美国)。RNAspin Mini试剂盒(GE Healthcare，美国)。BestarTMqPCR试剂盒(DBI Bioscience公司，德国)。抗体、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀释，#ab6721)(Abcam公司，美国)。聚偏二氟乙烯膜(EMD Millipore，美国)。ECL 显色试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)。

1.2 分组、建模与干预 45只大鼠随机分为对照组、MI组和MI+蒲参胶囊组(n=15)。根据参考文献建立MI大鼠模型[5]，将MI组和MI+蒲参胶囊组的大鼠连接心电图，麻醉(4%水合氯醛)后连接心电图，后迅速打开胸小心撕开心包腔暴露心脏，利用5-0号缝合线结扎冠脉降支，但不需要结扎很近，心电图ST段升高至>0.5 mV即可。然后，将心脏迅速放回胸腔内，简单缝合胸腔，腹腔注射8×105U的青霉素预防感染。对照组大鼠仅暴露心脏相同时间但不结扎。MI+蒲参胶囊组大鼠在建模后通过蒲参胶囊灌胃处理，剂量为40 mg/kg[6]，1次/d，连续4周。

1.3 方法

1.3.1 心功能检测:通过HP SONOS 5500 超声心动图仪的双通道左心室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)，从而评估心室射血功能和收缩功能。

1.3.2 心室重构情况:吸入过量二氧化碳安乐死大鼠，测量体重(g)；取出心脏组织并称重(mg)；然后分理处心室组织并称重(mg)。通过检测心脏和心室组织与体质量的比值(mg/g)作为心脏指数和心室指数，从而分析心室重构情况。

1.3.3 HE染色:HE染色检测大鼠左心室心肌组织的病理变化。心肌组织组织用10%甲醛溶液固定48 h，流水冲洗。不同浓度的乙醇脱水，然后将组织浸入蜡中，并切成 4～7 μm 的厚度。将载玻片置于 65℃恒温烘箱中 30 min。脱蜡切片用不同浓度乙醇浸泡5 min，自来水冲洗10 min。然后将切片分别用伊红溶液染色1～2 min。细胞核用苏木精染色5 min。染色切片用纯酒精脱水并在光学显微镜下检查。

1.3.4 RT-qPCR:使用RNeasy Mini试剂盒取将左心室心肌组织中的总RNA逆转录为cDNA，条件如下：37℃/15 min；98℃/5 min。然后使用BestarTMqPCR预混液进行qPCR实验，条件如下：95℃/2 min， 94℃/20 s，58℃ 20 s，72℃/20 s，40个循环，最后在72℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行RT-qPCR分析。通过比较循环阈值并以GAPDH作为内参计算TGF-β1和Smad mRNA相对表达水平。

1.3.5 Western blot检测蛋白:将左心室心肌组织织用匀浆机均匀研磨萃取总蛋白，通过BCA试剂盒测量浓度。每组取40 μg的总蛋白使用SDS-PAGE分离(10%，80～120 V，90 min)。在100 mV的恒定电压下与PVDF膜进行湿转移。在5%牛血清白蛋白(BSA)中于室温孵育1 h。将1∶500稀释的TGF-β1和Smad一抗添加膜中(4℃，12 h)。洗涤后在加入1∶2 000稀释的二抗孵育室温下1 h。利用化学发光试剂盒显色。用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 蒲参胶囊对MI大鼠心功能的影响 3组大鼠的左心室舒缩功能比较差异显著(P<0.05)。MI组LVE和LVFS显著低于对照组(P<0.05)，MI+蒲参胶囊组心脏指数LVEF和LVFS显著高于MI组(P<0.05)。见表1。

表1 蒲参胶囊对MI大鼠心功能的影响

2.2 蒲参胶囊对MI大鼠心室重构的影响 3组大鼠的心脏指数和心室指数比较差异显著(P<0.05)。MI组心脏指数[(3.94±0.42)mg/g]和心室指数[(2.38±0.25)mg/g]显著高于对照组(P<0.05)，MI+蒲参胶囊组心脏指数[(2.86±0.31)mg/g]和心室指数[(1.56±0.16)mg/g]显著低于MI组(P<0.05)。见表2。

表2 蒲参胶囊对MI大鼠心脏指数和心室指数的影响

2.3 蒲参胶囊对MI大鼠左心室心肌组织损伤的影响 对照组细胞核染色清晰，细胞质染色均匀，细胞排列有序。MI组细胞核染色变深或变浅，心肌细胞染色变浅，形状发生改变，排列紊乱，并且细胞外基质大量增生。MI+蒲参胶囊组组细胞排列异常和损伤情况均较轻。见图1。

图1 蒲参胶囊对MI大鼠左心室心肌组织损伤的影响(HE染色×400)

2.4 蒲参胶囊对MI大鼠TGF-β1和Smad mRNA表达水平的影响 3组大鼠左心室心肌组织中TGF-β1和Smad mRNA表达水平比较差异显著(P<0.05)。MI组的TGF-β1和Smad mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)，MI+蒲参胶囊组的TGF-β1和Smad mRNA水平显著低于MI组(P<0.05)。见表3。

表3 蒲参胶囊对MI大鼠TGF-β1和Smad mRNA表达水平的影响

2.5 蒲参胶囊对MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表达水平的影响 3组大鼠左心室心肌组织中TGF-β1和Smad蛋白表达水平比较差异显著(P<0.05)。MI组的TGF-β1和Smad蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)，MI+蒲参胶囊组的TGF-β1和Smad蛋白水平显著低于MI组(P<0.05)。见图2，表4。

图2 Western blot检测蒲参胶囊对MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表达水平的影响

表4 蒲参胶囊对MI大鼠TGF-β1和Smad蛋白表达水平的影响

3 讨论

每年约有1 730万的患者死于心血管疾病，是公共卫生系统面临的重大挑战[7]。心肌梗死是最常见的心血管疾病之一，会导致心室功能障碍、耗氧量增加和心肌细胞的凋亡，并且出现胶原纤维增生，最终引起心室重构和心肌纤维化[8]。

蒲参胶囊是一种由何首乌、蒲黄、丹参、川芎、赤芍、山楂、泽泻组成的胶囊剂，其具有活血祛淤，滋阴化浊之功效[9]。现阶段，临床上蒲参胶囊重要用于治疗高血脂引起的心脑血管病变，或者用于减轻脑梗死相关疾病[10,11]。如一项临床研究显示蒲参胶囊可通过保护血管缓解轻度认知障碍[11]。MI过程与脑梗死相似，为研究蒲参胶囊对MI的影响，本研究通过栓线法构建MI大鼠模型，并通过蒲参胶囊灌胃干预4周。结果显示MI模型大鼠的LVEF和LVFS降低，说明左心室射血功能和舒缩功能异常，并且心脏指数和心肌指数升高，提示出现心肌增生重构。蒲参胶囊能够显著恢复MI大鼠的心功能，并减少左心室心肌组织损伤和心室重构。MI过程会导致大量活性氧自由基的生成，从而诱发细胞内的炎性反应，有研究显示蒲参胶囊可缓解心肌缺血再灌注损伤抑制炎性反应。结合文献报道和本次研究结果，说明蒲参胶囊能够缓解MI大鼠的心肌损伤，并抑制心室重构，保护心室舒缩功能从而改善心脏的射血功能。

本研究检测了蒲参胶囊对MI大鼠左心室心肌组织中TGF-β1/Smad通路转录和蛋白表达水平的影响。如前所述，MI后诱发的氧化应激、炎性反应、免疫反应等均会引起心肌组织的纤维化，从而导致心室重构并导致心肌组织失去弹性影响射血功能[12]。TGF-β1是纤维化最关键因子之一，其高表达会激活Smad的转录功能，从而促进胶原蛋白或者细胞外基质蛋白的转录和翻译，导致心脏纤维化[13]。并且抑制TGF-β1/Smad可显著的抑制纤维化保护心功能[14]。本次研究结果显示MI模型大鼠左心室心肌组织中TGF-β1、Smad mRNA和蛋白水平显著升高，而蒲参胶囊抑制则可显著的抑制TGF-β1和Smad的转录和蛋白表达。刘永萍等[15]研究显示蒲参胶囊可显著抑制TGF-β1的表达，从而保护动脉粥样硬化患者的血管功能。结合文献报道和本次研究结果，提示蒲参胶囊可能通过抑制TGF-β1/Smad通路缓解心肌损伤和心室重构，从而保护心室的射血功能。

综上所述，蒲参胶囊可能缓解MI大鼠心室重构改善心室的射血功能，并抑制TGF-β1/Smad通路。本研究结果提示蒲参胶囊可有效的保护MI后的心脏功能，可能成为治疗MI的新方法。