沙利度胺联合顺铂对宫颈癌Hela细胞Elk1信号转导分子活性的影响

刘彩茹 冯海芹 王玉红 张丽娜 杨丽萍

宫颈癌是继乳腺癌之后第二大最常见的女性癌症，严重影响着全世界女性的健康特别是在发展中国家[1]。宫颈癌由某些癌基因和抑癌基因的异常表达引起，尽管由于HPV疫苗的使用已大大降低了宫颈癌的发病率，但宫颈癌仍是全世界癌症相关死亡的第三大诱因[2]。目前虽然在宫颈癌的治疗技术取得了较大的进步，但宫颈癌患者的5年总生存率仍然只保持在60%～70%，且在近40年中没有显著下降[3]。宫颈癌在早期诊断方面取得了巨大的进步，但是晚期宫颈癌患者的预后仍然很差[4]。常规上，化学疗法，放射疗法和外科手术是所有患者的常用疗法，但是，这些常规疗法中的大多数对患者具有严重的不良影响[5]。替代药物已成为一种潜在的治疗方法，具有较少的不良反应和更实惠的成本[6]，尤其是抗癌药物发现和开发的主要来源[7]。Elk1是一种转录激活因子，可调节涉及增殖和转移的多种基因，例如原癌基因c-fos等转录复合体[8]。研究报道发现，ELK1在多种癌症(如膀胱癌)中起癌基因的作用[9]。越来越多的研究发现沙利度胺和顺铂对宫颈癌细胞具有抑制作用，但是对沙利度胺联合顺铂对Elk1转录因子的表达和活性在宫颈癌细胞中的研究较少，且Elk1可能是药物治疗的一个重要靶点，因此研究宫颈癌的诊断生物标志物和治疗策略具有重要的意义。本实验研究沙利度胺联合顺铂对宫颈癌Hela细胞Elk1信号转导分子活性的影响，以及其联合作用对宫颈癌细胞增殖的抑制作用，并试图从机制上阐明沙利度胺联合顺铂对宫颈癌细胞的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HeLa宫颈癌细胞获自河北医科大学第四附属医院科研中心细胞库，顺铂购自齐鲁制药有限公司(中国)，沙度利胺购自江苏常州制药厂(中国)。

1.2 细胞培养和处理 将细胞在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中于37℃在含有5%CO2的潮湿气氛中培养。将培养的细胞随机分成4组，分别为对照组(CK)-正常培养，不加任何处理；沙利度胺组(Thal)-用400 mg/L沙利度胺处理；顺铂组(PDD)-用1 mg/L顺铂处理和沙利度胺联合顺铂组(Thal+PDD)，每组3个重复，并24 h后进行观察和检测。

1.3 细胞凋亡检测与免疫组织化学(IHC)分析 细胞凋亡通过FITC/PI细胞凋亡试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)测量。将收集细胞并将其重悬于膜联蛋白V结合缓冲液(5×106/ml)中，然后在黑暗中将细胞与Annexin V/FITC混合5 min。之后向细胞溶液中加入10 μl PI染料和400 μl PBS，进行流式细胞仪进行凋亡分析。石蜡包埋切成4 μm的切片，在与抗ALK1或抗Ki67孵育之前(20 min，1∶500)进行去石蜡，补液和抗原回收(微波，30 min)。接下来通过使用DAB方法显影切片，用苏木精染色2次，用梯度乙醇脱水，并用中性树脂固定后，观察组织切片并在显微镜的5个随机视野中成像。

1.4 荧光素酶活性检测 使用FLUROStar荧光检测仪：取出96孔板室温融化，每孔取30 μl移入96孔荧光板，使用能够自动加样的FLUROStar检测荧光素酶活性。先加入萤火虫(Firefly)荧光素酶底物25 μl/孔，检测萤火虫荧光素酶活性，再加入终止液和海肾(Renilla)荧光素酶底物25 μl/孔，检测内对照海肾荧光素酶活性。

1.5 RNA提取和RT-PCR 使用TRIzol试剂(Invitrogen，CA，USA)提取细胞系的总RNA，然后使用逆转录试剂盒(Takara，Otsu，Shiga，Japan)合成cDNA。通过使用FTC-3000实时定量热循环仪(Funglyn Biotech Inc.，上海)测量mRNA表达。引物序列如下：ELK1，5’-GGC TAC GCA AGA ACA AGACCAAC-3’(正向)和5’-AGA CGA ACT TCT GGC CGC TCA-3’(反向)；c-fos，5’-CCACCTTCACCATCCAGTCT-3’(正向)和5’-TCTTCCGATTTCAGGTTTGG-3’ (反向)；caspase-8，5’-TCTTCCCTGGCTTGGC-3’(正向)，5’-TG

GGCTCTTTCGT GGC-3’(反向)，caspase-9，5’-CTCCA

GCTCACACAACTCCA-3’ (正向)，5’-TGTTTCAGCTG

TGCCACTTC-3’ (反向)；GAPDH，5’-GTCAACGGATT

TGGTCTGTATT-3’(正向)和5’-AGTCTTCTGGGTGGC

AGTGAT-3’(反向)。所有mRNA表达均以GAPDH做内参并用 2-ΔΔCt法计算基因表达定量。

1.6 Western Blot 处理后，使用放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(Shenneng Bocai)提取细胞的总蛋白。使用双辛可宁酸(BCA)方法测量蛋白质浓度。然后使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离20 mg蛋白质。用标准技术进行免疫检测，ELK1、c-fos、caspase-8、caspase-9和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的抗体购自Cell Signaling Technology(荷兰莱顿)。通过化学发光(ECL)开发系统可视化的蛋白条带。用ImageJ软件进行蛋白质密度的定量。

2 结果

2.1 药物处理后对Hela细胞增殖的影响 与对照组比较，沙利度胺组和顺铂组宫颈癌细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)；与沙利度胺组和顺铂组比较，联合组宫颈癌细胞增殖抑制率显著升高。见表1。

表1 4组药物处理后对Hela细胞增殖的影响

2.2 沙利度胺联合顺铂对宫颈癌细胞Elk1表达和活性的影响 与对照组比较，沙利度胺组和顺铂组Elk1的mRNA相对表达水平和Elk1转录因子活性均显著下降(P<0.05)；与与沙利度胺组和顺铂组比较，联合组宫颈癌细胞中Elk1的mRNA相对表达水平和Elk1转录因子活性均显著下降(P<0.05)。见表2。

表2 沙利度胺和顺铂处理后Hela细胞中Elk1的mRNA表达和Elk1荧光酶活性检测

2.3 宫颈癌细胞中c-fos和caspase-8基因的表达 与对照组比较，沙利度胺组和顺铂组宫颈癌细胞中c-fos的mRNA相对表达水平显著下调，caspase-8的mRNA相对表达水平显著上调(P<0.05)；与沙利度胺组和顺铂组比较，联合组宫颈癌细胞中c-fos的mRNA相对表达水平显著下调，caspase-8的mRNA相对表达水平显著上调(P<0.05)。见表3。

表3 沙利度胺和顺铂处理后Hela细胞中c-fos和caspase-8基因的相对表达水平

2.4 Elk1和c-fos蛋白在宫颈癌细胞中的表达 与对照组比较，沙利度胺组和顺铂组宫颈癌细胞中Elk1和c-fos蛋白的相对表达水平均显著下调(P<0.05)；与沙利度胺组和顺铂组比较，联合组宫颈癌细胞中Elk1和c-fos蛋白的相对表达水平均显著下调(P<0.05)。见表4，图1。

表4 沙利度胺和顺铂处理后Hela细胞中Elk1和c-fos蛋白的相对表达水平

图1 沙利度胺和顺铂处理后Hela细胞中Elk1和c-fos蛋白的相对表达水平

2.5 沙利度胺联合顺铂对宫颈癌细胞caspase-8蛋白表达影响 结果显示，与对照组相比，沙利度胺组和顺铂组宫颈癌细胞中caspase-8蛋白的相对表达水平均显著上调(P<0.05)；与沙利度胺组和顺铂组比较，联合组宫颈癌细胞中caspase-8蛋白的相对表达水平均显著上调(P<0.05)。见表4，图2。

图2 沙利度胺和顺铂处理后Hela细胞中Caspase-8蛋白相对表达水平

3 讨论

宫颈癌是女性所有癌症死亡的最常见原因之一，特别是在发展中国家[10]。像大多数癌症一样，宫颈癌在疾病的早期发展过程中没有任何迹象[11]。但是，通常在肿瘤引起阴道分泌物和出血时出现症状，转移患者也可能出现其他症状，包括疼痛或腰酸[12]。因此，大多数注意到症状的患者通常在肿瘤发展的后期阶段。尽管诊断出患有早期宫颈癌的女性的5年总生存率超过90%[13]，但宫颈癌目前是全球女性中第四大最常见的癌症[14]。

ELK1是各种类型的癌症中ETS癌基因家族的成员，是ETS转录因子之一，其功能是利用保守的ETS DNA结合域来介导转录调控的转录因子[15]。ELK1在ETR的反式激活域中被多磷酸化，从而将其转化为有效的转录激活因子，属于成红细胞转化特异性(Ets)结构域蛋白的亚家族，通过富嘌呤的GGA核心序列与DNA特异性序列结合，ELK1调节包括原癌基因在内的多种基因的表达[16]。当ELK1被磷酸化时，它易位至细胞核并激活下游靶标，成为激活因子[17]。细胞外信号调节激酶/MAPK信号通路在许多生物学过程中起着重要作用，并且在包括癌症在内的几种疾病状态中经常被调节[18]。MAPK信号主要通过激活包括ELK1在内的转录因子来促进基因表达[19]。

激活的ELK1与ELK1元件结合以调节靶基因表达，先前的研究表明，ELK1介导的靶基因网络调节与肌动蛋白细胞骨架调节和细胞迁移有关。该网络中重要的ELK1靶基因部分控制着细胞骨架相关的活动，包括细胞迁移[20]。与先前的研究一致，本研究的结果表明，沙利度联合顺铂引起的ELK1转录活性的降低，以及靶基因c-fos基因和蛋白表达的下调可能是抑制宫颈细胞系中细胞增殖的原因。此外，已经发现ELK1在宫颈癌组织中显著上调[21]。相似的，在本研究中也验证了ELK1在宫颈癌组织中的表达明显上调。沙利度与顺铂的联合使用可降低宫颈癌细胞中ELK1的荧光素酶活性和蛋白表达，表明ELK1可能是这种药物的靶基因，从而起到抑制细胞增殖，迁移和侵袭的作用。本研究的结果表明，与沙利度和顺铂单独处理相比，联合使用后使宫颈癌细胞中ELK1和c-fos的表达水平降低，并且抑制细胞增殖和侵袭。因此，在宫颈癌中鉴定ELK1可能有助于了解潜在的肿瘤发生分子机制，并为宫颈癌的治疗提供新的预后标记。

本研究中，结果发现ELK1是沙利度联合顺铂的直接靶标，其可以降低宫颈癌细胞中ELK1的表达和活性，通过RT-PCR检测了磷酸化的Elk1靶基因c-fos及膜受体通路基因caspase-8的表达及对人宫颈癌细胞的作用。结果表明，Elk1靶基因c-fos在Hela细胞内被显著下调，膜受体通路基因caspase-8基因显著上调，因此说明沙利度联合顺铂可抑制宫颈癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，这为进一步研究ELK1转录因子和宫颈癌的治疗方法提供了一些理论依据和参考。