红树莓提取物通过miR-194-5p/PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制研究

杨学军 全信保 王强

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率呈增长趋势，严重威胁人类生命健康[1]。由于胃癌发病隐匿，早期缺乏典型的临床特征，多数患者确诊时已处于中晚期[2]。目前，胃癌的治疗缺乏有效方法，寻找并研发用于治疗胃癌的药物尤为重要。红树莓俗称覆盆子、托盘等，其营养物质丰富，被誉为“黄金水果”。红树莓富含原花青素、酚酸类、黄酮类和三萜等多种活性物质，具有抗动脉粥样硬化、降血脂、抗氧化等活性[3-5]。研究显示，红树莓提取物可降低肝癌SMMC-7721细胞的增殖能力，其作用机制与AKT通路调控的cyclinA-CDK2介导的S期阻滞有关[6]。但目前，红树莓提取物能否影响胃癌细胞的恶性表型还未知。微小RNA(miRNA)是一类小分子非编码RNA，其参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移等恶性表型，可作为肿瘤治疗的分子靶点[7]。有报道称，miR-194-5p在胃癌组织和细胞系中表达下调，通过上调其表达可有效削弱胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，miR-194-5p有可能成为胃癌治疗的分子靶点[8]。本研究以胃癌细胞AGS为研究对象，主要探讨了红树莓提取物对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其能否通过调控miR-194-5p发挥作用，以期为其用于胃癌的治疗提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 AGS细胞系，中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)，杭州四季青；RPMI 1640培养基、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒，北京索莱宝；LipofectamineTM 2000试剂盒，美国Invitrogen公司；miR-194-5p抑制剂(anti-miR-194-5p)、抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC)及PCR引物，上海吉玛制药技术；兔抗人基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)抗体，美国Santa Cruz公司；RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物。

1.2 方法

1.2.1 红树莓提取物制备:红梅提取物的制备参照文献方法[9]：准确称取100 g红树莓样品，加300 ml 80%预冷乙醇，用乳化匀浆器搅拌提取4 h。离心15 min(3 500 r/min)后，将滤液真空旋转浓缩至约5～10 ml，冷冻干燥。准确称取一定量的干燥后产物，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配置浓度为0.5 g/ml的母液，4℃保存，使用时培养基稀释。

1.2.2 AGS细胞培养与转染:用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养AGS细胞。取对数期AGS细胞，将其接种至6孔板中(2.5×105个/孔)。当细胞生长密度达80%时，用LipofectamineTM 2000脂质体法分别转染anti-miR-NC、anti-miR-194-5p至AGS细胞。转染12 h后，更换新鲜培养基，再培养24 h，RT-qPCR检测细胞中miR-194-5p表达验证转染效果，并收集细胞备用。

1.2.3 细胞分组:未转染的AGS细胞分为对照组(NC组)，不同浓度(20、40、80、160 mg/ml)红树莓提取物组，其中NC组细胞用常规培养基培养，不同浓度(20、40、80、160 mg/ml)红树莓提取物组细胞分别用含红树莓提取物终浓度为20、40、80、160 mg/ml的培养基干预。转染anti-miR-NC、anti-miR-194-5p的AGS细胞用含红树莓提取物终浓度为80 μg/ml的培养基干预，记为80 mg/ml红树莓提取物+anti-miR-NC组、80 mg/ml红树莓提取物+anti-miR-194-5p组。

1.2.4 CCK-8检测细胞增殖:取未转染、转染后的AGS细胞，均接种至96孔板中(2.5×104个/孔)，培养4 h后，弃培养基，按1.2.3分组处理。处理24 h后，加10 μl CCK-8，孵育2 h，用酶标仪(λ=450 nm)检测各孔吸光度(A)值。

1.2.5 Transwell法检测细胞迁移和侵袭:取未转染、转染后的AGS细胞，均接种至6孔板中(2.5×105个/孔)，培养4 h后，弃培养基，按1.2.2分组处理。处理24 h后，收集各组细胞，并将其密度调整为5.0×104个/ml。细胞侵袭：将Transwell小室置于24孔板中，上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后加100 μl细胞悬液。下室加500 μl培养基。培养4 h后，弃培养基，按1.2.2分组处理，处理24 h后，弃培养基，用多聚甲醛固定、结晶紫染色，显微镜观察。随机取5个视野，记数。迁移实验无需铺Matrigel基质胶，剩余操作步骤与同侵袭实验。

1.2.6 蛋白质印迹法实验检测MMP-2、MMP-9、p-PI3K和p-AKT蛋白表达:未转染、转染后的AGS细胞，均接种至6孔板中(2.5×105个/孔)，培养4 h后，弃培养基，按1.2.2分组处理。处理24 h后，用RIPA试剂提取细胞中总蛋白。经BCA法定量后，行SDS-PAGE电泳。然后转膜、封闭后，分别用MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)、p-PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育液在4℃冰箱中孵育过夜。洗膜后，用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液在37℃摇床中孵育1 h。加显影液避光显影，曝光拍照，Image J软件分析MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-AKT相对于β-actin的表达量。

1.2.7 RT-qPCR实验检测miR-194-5p表达:取未转染、转染后的AGS细胞，均接种至6孔板中(2.5×105个/孔)，培养4 h后，弃培养基，按1.2.2分组处理。处理24 h后，用RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA。经逆转录后，行PCR扩增。扩增程序为95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环。引物序列：miR-194-5p上游5’-GCGGCGGTGTAACAGCAACT

CC-3’，下游5’-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’；U6上游5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’，下游5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。2-△△Ct法计算miR-194-5p相对于U6的表达量。

2 结果

2.1 红树莓提取物抑制胃癌细胞AGS增殖活性 与NC组比较，胃癌细胞AGS经不同浓度(20、40、80、160 mg/ml)的红树莓提取物干预24 h后，细胞A值明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2 红树莓提取物抑制胃癌细胞AGS迁移和侵袭 与NC组比较，胃癌细胞AGS经不同浓度(20、40、80、160 mg/ml)的红树莓提取物干预24 h后，细胞迁移数和侵袭数明显降低(P<0.05)，MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低(P<0.05)。见图1，表2。

表1 红树莓提取物对AGS细胞增殖活性的影响

图1 Western Blot检测MMP-2、MMP-9蛋白的表达

表2 红树莓提取物对AGS细胞迁移和侵袭的影响

2.3 红树莓提取物促进胃癌细胞AGS中miR-194-5p的表达 与NC组比较，胃癌细胞AGS经不同浓度(20、40、80、160 mg/ml)的红树莓提取物干预24 h后，细胞中miR-194-5p的表达明显升高(P<0.05)。见表3。

表3 红树莓提取物对AGS细胞中miR-194-5p表达的影响

2.4 敲减miR-194-5p可降低红树莓提取物对胃癌细胞AGS增殖、迁移和侵袭的影响 转染anti-miR-194-5p的胃癌细胞AGS中miR-194-5p表达量明显低于转染anti-miR-NC的细胞(0.39±0.03、1.00±0.09，t=19.290，P<0.05)，表明敲减miR-194-5p的AGS细胞构建成功。与转染anti-miR-NC的AGS细胞比较，80 mg/ml的红树莓提取物作用的敲减miR-194-5p的AGS细胞A值升高(P<0.05)，迁移数和侵袭数升高(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表达升高(P<0.05)。见表4，图2。

表4 敲减miR-194-5p降低红树莓提取物对AGS细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图2 Western Blot检测MMP-2、MMP-9蛋白的表达

2.5 红树莓提取物对胃癌细胞AGS中PI3K/AKT信号通路的影响 与NC组比较，胃癌细胞AGS经80 mg/ml的红树莓提取物干预24 h后，细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达明显降低(P<0.05)。而与转染anti-miR-NC的AGS细胞比较，80 mg/ml的红树莓提取物作用的敲减miR-194-5p的AGS细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图3，表5。

图3 Western Blot检测p-PI3K、p-AKT蛋白表达

表5 PI3K/AKT信号通路蛋白表达情况

3 讨论

我国是红树莓的多产国之一，但目前对红树莓的研究尤其是其在医药用品的应用开发还不够深入。近年来研究显示，红树莓提取物具有抗肿瘤作用。有报道称，红树莓提取物可能通过调节PTEN/AKT信号传导途径抑制肝细胞癌细胞增殖[10]。本研究结果显示，胃癌细胞经不同浓度(20、40、80、160 mg/ml)的红树莓提取物干预24 h后，细胞A值、迁移数和侵袭数均显著降低，这表明红树莓提取物可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，具有一定抗胃癌作用。细胞迁移和侵袭受多种基因分子及信号通路的调控。MMP是一类可降解细胞外基质的酶类，其中MMP-2和MMP-9是目前研究最多的影响肿瘤细胞迁移和侵袭的MMP。MMP-2和MMP-9可通过降解肿瘤细胞外基质，促进肿瘤细胞迁移和侵袭[11]。本研究结果显示，红树莓提取物可降低胃癌细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达，提示其可能通过调控MMP-2和MMP-9来抑制胃癌细胞迁移和侵袭。

miRNA参与调控肿瘤细胞的恶性表型，为肿瘤治疗提供了分子靶点。研究已表明，miR-125b-5p[12]、miR-362[13]和miR-106b-5p[14]等多种miRNA参与胃癌的发展进程，是胃癌治疗的潜在分子靶点。研究显示，膀胱癌[15]、透明细胞肾细胞癌[16]、神经胶质瘤[17]、喉癌[18]和肝细胞癌[19]等肿瘤中miR-194-5p表达明显降低，miR-194-5p作为抑癌基因参与这些肿瘤的发展进程；而miR-194-5p在卵巢癌[20]和乳腺癌[21]中表达升高，促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭等，发挥促癌基因作用。Ding等[22]研究显示，lncRNA TP73-AS1在胃癌组织和细胞系中表达上调，其通过靶向抑制miR-194-5p并上调SDAD1的表达来促进胃癌细胞生长和转移，TP73-AS1/miR-194-5p/SDAD轴为胃癌的治疗提供了潜在分子靶点。本研究结果显示，红树莓提取物可有效促进胃癌细胞中miR-194-5p的表达，而敲减miR-194-5p降低红树莓提取物对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，提示红树莓提取物可能通过上调miR-194-5p表达来阻碍胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。

PI3K/AKT信号通路是参与调控细胞增殖、凋亡等生命活动的重要通路，其在肿瘤中处于激活状态，阻断该通路可有效抑制肿瘤细胞的恶性表型[23]。近年来研究显示，miRNA参与调控PI3K/AKT信号通路，进而影响肿瘤发展进程。例如，m2巨噬细胞源性外泌体miR-15a和miR-92a可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制神经胶质瘤细胞迁移和侵袭[24]；miR-15b通过抑制PI3K/AKT信号通路降低食道癌细胞的活力、迁移和侵袭，并促进食道癌细胞凋亡[25]；miR-489可通过靶向HDAC7阻断PI3K/AKT途径，进而抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[26]。本研究结果显示，胃癌细胞经80 mg/ml的红树莓提取物干预后，细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达明显降低，提示红树莓提取物可抑制胃癌细胞中PI3K/AKT信号通路的激活；而敲减miR-194-5p降低了红树莓提取物对胃癌细胞中PI3K/AKT信号通路的抑制作用，进一步提示红树莓提取物可能通过靶向miR-194-5p进而抑制PI3K/AKT信号通路来发挥抗胃癌作用。

综上，一定剂量的红树莓提取物能够削弱胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制可能与上调细胞中miR-194-5p表达并阻碍PI3K/AKT信号通路的传导有关，具有治疗胃癌的潜在价值。但本研究仅通过体外细胞进行了初步探究，尚需要在体内进一步验证红树莓提取物的抗胃癌作用及具体的作用机制。