肾着汤对寒湿性腰腿痛小鼠模型的治疗作用机制研究

孙秀玲，张靖涵

（1.山东中医药高等专科学校医学系，山东烟台 264199；2.滨州医学院烟台校区特殊教育学院，山东烟台 264033）

腰腿痛是临床常见腰腿部退行性疾病，以腰部疼痛并放射至下肢引起局部麻木疼痛为主要表现。近年来，随着老龄化进程加快，腰腿痛发病率逐年上升[1]。腰腿痛发病机制复杂，与腰椎间盘突出、腰椎管狭窄、腰肌劳损等密切相关。目前，现代医学对腰腿痛治疗包括内治和外治方法，但内科中成药药物治疗疗效差异显著，外科手术治疗存在一定风险，且具有较严格的适应证和禁忌证，限制了临床应用[2-3]。中医学具有疗效肯定、安全性高特点。近年来，随着国家对中医药发展的重视，中医药在腰腿痛治疗中的作用备受临床关注[4]。寒湿性腰腿痛是临床常见证型，肾着汤即甘姜苓术汤，出自《金匮要略》，既往已有报道将其用于腰椎间突出症患者，对改善腰腿痛起到显著效果[5]。本研究通过建立动物模型，进一步观察其在寒湿性腰腿痛中的临床效果和作用机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究30只实验动物均为BALB/c清洁级健康小鼠[山东大学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK（鲁）20090001]，雌雄各半。小鼠周龄10～12周，体质量16～20 g，平均体质量（18.35±1.62）g。小鼠均在自然光周期条件下饲养，控制室温在20～22 ℃，相对湿度65%～70%，颗粒饲料和垫料均由山东中医药高等专科学校实验中心提供。采用随机数字表法将30只小鼠分为A组、B组和C组，每组10只。A组小鼠中雌性6只，雄性4只；周龄10～12周；体质量16～19 g，平均体质量（17.96±1.50）g。B组小鼠中雌性5只，雄性5只；周龄10～12周；体质量16～20 g，平均体质量（18.02±1.47）g。C组小鼠中雌性4只，雄性6只；周龄10～12周；体质量17～20 g，平均体质量（18.15±1.63）g。3组小鼠一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），组间具有可比性。本实验经山东中医药高等专科学校动物实验伦理审查批准。

1.2 研究方法 ①A、B两组小鼠建模。建模方法：将小鼠放入500 mL烧杯中，烧杯倒入250 mL水，水温＜12 ℃，浸泡30～90 min。观察到小鼠腰腿不利、难以正常行走、浑身战栗提示寒湿性腰腿痛建模成功。②干预方法。A组小鼠给予肾着汤干预，组方：甘草6 g、白术6 g、干姜12 g、茯苓12 g。中药购自山东中医药高等专科学校附属医院中药房，由中药房煎制，每1 mL含生药为0.18 g，制成真空包装，低温保存备用。按生药1.8 g/kg计算剂量，灌胃，早晚各1次，连续干预3周。B组和C组小鼠给予常规喂养。③检测方法。在肾着汤干预3周后记录3组小鼠扭体潜伏期和扭体次数。采集小鼠腹主动脉血3 mL，采用台式高速离心机[上海医疗器械集团有限公司，沪食药监械(准)字2012第1410290号，型号：GL-18B型]对血液标本以3 000 r/min离心10 min，采用全自动血流变测试仪[上海涵飞医疗器械有限公司，京药监械(准)字2012第2400319号，型号：ZL6000型]检测血浆黏度，计算红细胞聚集率和红细胞变形指数。然后将小鼠全部处死，取小鼠竖脊肌组织，分别采用实时荧光定量-聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组化法检测小鼠组织中血管内皮生长因子（VEGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）及神经生长因子（NGF）相对表达量和蛋白表达水平，以β-actin为内参照以2-ΔΔCt法计算表示相对表达量。qRT-PCR引物设计见表1，反应条件：95 ℃预变性30 s、变性5 s，60 ℃退火40 s，循环40次。免疫组化（SP法染色）检测结果判断标准：以着色为细胞结果阳性，以着色面积表示阳性细胞，见表2。以两项评分之和≥3分为结果阳性[6]。

表1 qRT-PCR引物序列

表2 免疫组化结果判断标准

1.3 观察指标 ①比较3组小鼠干预后扭体潜伏期和扭体次数。②比较3组小鼠血浆黏度、血小板聚集率及红细胞变形指数。③比较3组小鼠VEGF、PCNA及NGF相对表达量和阳性率。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以（x）表示，多组间比较行方差分析，两两比较行LSD-t检验；计数资料以[例(%)]表示，组间比较行χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠干预后扭体潜伏期和扭体次数比较 C组小鼠扭体潜伏期显著长于A组和B组，扭体次数显著少于A、B两组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；A组小鼠扭体潜伏期长于B组，扭体次数少于B组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表3 3组小鼠干预后扭体潜伏期和扭体次数比较（x）

2.2 3组小鼠血液流变学水平比较 C组小鼠血小板聚集率和红细胞变形指数均低于A、B两组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；A组血浆黏度、血小板聚集率及红细胞变形指数水平显著低于B组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 3组小鼠血液流变学水平比较（x）

2.3 3组小鼠VEGF、PCNA及NGF表达水平比较 A组小鼠竖脊肌组织中NGF相对表达量和阳性率均显著低于B组，VEGF和PCNA相对表达量和阳性率均高于B组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表5。

表5 3组小鼠VEGF、PCNA及NGF表达水平比较

3 讨论

腰腿痛属中医痹症范畴，其病位在肾。《景岳全书》明确记载，腰痛证，遇阴雨或久坐痛而垂者，湿也；遇诸寒而痛及喜暖而恶寒者，寒也[7]。中医药在腰腿痛治疗中历史悠久，腰腿痛的治疗当以温肾散寒、舒经通络为治法。肾着汤配方较为简便，以干姜配甘草，发挥温中散寒功效，另以茯苓、白术健脾除湿。周佳明等[8]研究也证实，肾着汤具有祛寒除湿功能，不仅有助于减轻局部腰腿痛症状，还可改善腰背部肌群协调性，缓解腰肌劳损，在腰腿痛治疗中具有重要价值。但目前临床对肾着汤的疗效机制尚不明确。本研究利用冷水浴方法建立寒湿性腰腿痛模型，并通过对比干预观察肾着汤的治疗效果，结果显示，干预后A组小鼠扭体次数显著少于B组，说明肾着汤能显著减轻局部疼痛，这与既往报道一致[9]。

NGF是机体重要的疼痛调控因子，在正常组织中低表达或不表达，在腰椎间盘突出症发生后，机械性压迫作用和炎性反应引起NGF表达增加[10]。VEGF是具有多种生物学功能的细胞因子，能增加血管通透性，促进血管再生，在椎间盘突出症病理进程中对缓解和修复椎间盘病变具有重要作用[11]。另外，PCNA与软骨细胞增殖水平具有显著相关性，是评估细胞增殖和修复能力的重要指标。随着腰腿痛康复进程加快，PCNA水平也随之升高[12]。临床也有研究显示，PCNA与VEGF存在正相关[13]，支持本研究结果。临床还有基础实验研究也证实，正常组、造模组及干预组小鼠PCNA水平差异较大[14]。本研究显示，A组小鼠竖脊肌组织中NGF相对表达量和阳性率均低于B组，而VEGF和PCNA显著高于B组，提示肾着汤可能通过调控VEGF、PCNA及NGF，延缓腰椎间盘突出等病理进程，发挥治疗作用。这一结果说明肾着汤可能通过调控机体神经血管因子，改善局部症状，达到治疗目的。另外，中医认为，寒凝血瘀也是引起腰腿痛的重要机制[15-16]。本研究还显示，A组小鼠血浆黏度、血小板聚集率及红细胞变形指数显著低于B组，提示肾着汤有助于改善寒湿性腰腿痛小鼠局部血流，这与肾着汤祛寒湿、健脾胃作用密切相关[17-18]，这也说明肾着汤可能通过改善局部微血流，纠正局部血液高凝状态，从而提高腰腿痛治疗效果，这对于临床早期干预具有重要实用价值[19]。

综上，肾着汤治疗寒湿性腰腿痛效果显著，有助于改善局部微血流，与其调节NGF、VEGF及PCNA等细胞因子水平有关。