分化可控的人类鼻粘膜类器官模型的建立

鼻腔粘液纤毛传输系统由呼吸道表面的黏液痰及其下方的纤毛上皮层组成。通过建立人类原代上皮细胞的体外模型，以及探究介导上皮细胞功能变化的潜在机制，对于研究呼吸道上皮在微生物感染或吸入剂作用下的关键功能至关重要。气液界面（ALI）培养的细胞在功能和结构上均贴近体内呼吸道上皮细胞的自然生长状态，为研究呼吸道上皮的功能和相关疾病奠定了良好的基础。

有研究讨论了上呼吸道原代培养的方法，然而均无法做到长期体外培养及以及维持原代细胞的分化能力。类器官是体外3D培养胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞或肿瘤干细胞，通过自我更新自我组织形成具有类似于来源器官组织形态结构、功能及遗传学特征的培养物。目前正常组织类器官主要来源于成体干细胞（包括祖细胞）及多能干细胞。与诱导性多能干细胞和多能干细胞（PSC）衍生的类器官发育模型相反，成体干细胞（ASC）衍生的上皮类器官概括了人体内正常组织的损伤修复作用。目前，基本上所有ASC派生的类器官类型仅代表器官的上皮部分，并且不存在细胞间基质，神经和脉管系统。因此，ASC衍生的类器官在结构上比PSC衍生的类器官具有更低的复杂性，原则上可以来自任何个体，衍生的类器官能够在体外长期扩增，同时保持遗传稳定性。

目前，国内外对鼻粘膜类器官的研究主要用作疾病发生发展机制的研究。未见使用Hans Clevers这一培养体系的鼻粘膜类器官的报道，本研究首次采用“扩增-分化”分段式培养法培养分化可控的鼻粘膜类器官，体外模拟鼻粘膜上皮的生长发育过程，以期为上呼吸道功能、相关疾病研究及病毒感染的基础研究提供理想平台。

1 材料和方法

1.1 标本来源

本研究有关人鼻息肉及中鼻甲的实验过程均在南方医科大学南方医院伦理委员会的监督指导下完成（伦理批件号：NFSC-2020-157）。人鼻息肉及中鼻甲组织的获取已获得患者的知情同意。人鼻息肉组织及中鼻甲组织取自南方医科大学南方医院鼻科行鼻内镜手术切除的慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉患者。

1.2 主要试剂和耗材

Transwell 板、鼠尾I型胶原（Corning）；IV型胶原酶、III型胶原酶（Worthington）；DNA酶、透明质酸酶、分散酶、抗β-tubulin（sigma）；抗AE1/AE3、抗MUC5AC、抗P63抗体、山羊抗兔及兔抗鼠二抗（Abcam）。

比如，在实际的教学过程中，教师可以按照教学内容，将其划分成“写作模块”以及“阅读模块”，随后教师可以在模块中进行细分，在阅读模块中，还可以存在以下几种分支：阅读理解、阅读识字、文章分析以及结构划分等。

1.3 混合胶的配制

先 将100 μL 1X DMEM 与1 mL Advanced DMEM/F12混合，再加入875 μL I型胶原，最后加入15 μL 1 mol/L无菌NaOH溶液,至此，该混合物称为混合胶原溶液，于4 ℃保存。将250 μL混合胶原溶液倒入transwell小室里的12 mm直径的内皿中，在37 ℃培养箱中固化30 min，备用。

1.4 类器官培养基的配制

不含Vit-A的B27，1×；N-acetylcysteine 1 mmol/L；EGF 50 ng/mL；Noggin 100 ng/mL；R-spondin1 250 ng/mL；Wnt3a 250 ng/mL；A83-01 500 nmol/L；Nicotinamide 10 mmol/L；Y-27632 10 μmol/L；Glutamax 1×；Gastrin 5 nmol/L；SB202190 10 μmol/L；青霉素链霉素混合液1×；IL-6 50 ng/mL；HEPES 1 mmol/L。

1.5 人鼻腔纤毛上皮细胞分离及培养

用含2%双抗的HBSS溶液震荡洗涤鼻息肉或中鼻甲手术剩余组织3～5次后将其置于冰上剪切至0.5 mm³以下。加入适量消化酶1（III型胶原酶300 U/mL+透明质酸酶0.1 mg/mL溶于DMEM/F12），37 ℃恒温消化2 h后再加入适量消化酶2（DNA酶5 mg/mL+分散酶5 mg/mL DMEM/F12）消化10 min，1500 r/min离心3 min，弃上清，加入HBSS溶液重悬。用100 μm滤网过滤得鼻粘膜上皮细胞。用红细胞裂解液去除其中的红细胞，离心后将细胞沉淀等分为2组：连续“扩增”培养组（EO组）及“扩增-分化”分段培养组（DO组），分别加入预先配制的混合胶中铺于上述备用的Transwell内皿中，外皿中加入类器官培养基，置于37 ℃细胞孵箱中。EO组加入鼻粘膜类器官培养基培养21 d，DO组加入鼻粘膜类器官培养基培养7 d后换为分化培养基培养14 d。培养基隔天更换1次，视类器官生长情况进行传代。

1.6 光镜下细胞形态观察

由于Transwell支持膜在湿润条件下呈透明状，不产生自发荧光，所以不影响光学显微镜和荧光染色等技术手段对细胞形态的观察。光镜下观察并记录鼻粘膜类器官生长及分化过程。

1.7 短串联重复序列（STR）检测

获取需要进行鉴定的来源组织及衍生的类器官后提取细胞DNA，通过多色荧光体系进行PCR 扩增，DNA片段分离荧光信号检测。数据分析后导出基因分析图谱，将受检鼻粘膜类器官STR位点的基因分型数据与其对应的来源组织基因分型数据进行比对并分析结果。若两者匹配度EV≥80%，则判定鼻粘膜类器官为来源组织的衍生培养物；若两者匹配度56%＜EV＜80%，建议结合鼻粘膜类器官形态、各细胞群特异性分子标记物鉴定等辅助手段进行综合判断；若两者匹配度EV≤56%，则判定鼻粘膜类器官与其对应的来源组织不相关。

1.8 鼻粘膜类器官免疫组化染色

取两组培养21 d的类器官固定于4%福尔马林溶液中12 h，石蜡包埋，制成4 μm厚的切片，脱蜡水化后加入枸橼酸盐溶液进行抗原修复，再加封闭液（4%BSA+0.5%Triton），封闭1 h。敷一抗，4 ℃过夜，第2天PBS洗5 min/3 次，37 ℃条件下敷二抗1 h。PBS 冲洗后DAB显色5～30 s，在显微镜下掌握染色程度。苏木精复染5 min，盐酸酒精分化2 s，流水冲洗15 min（返蓝）。最后切片经乙醇-二甲苯梯度脱水，在通风橱自然晾干再封片、镜检。每组染色均设立阴性对照（PBS液代替一抗），设立鼻粘膜组织为阳性对照。所有切片采用盲法由3名高年资病理科医师进行独立判定。

人才匮乏，已经成为印刷业发展的制约瓶颈。症结何在？出路何在？发展中的问题只能在发展中解决，办法总比困难多。

纳入该院收治的糖尿病骨折76例，采用数字抽选法将其分为对照组和研究组各38例。其中常规组38例患者，男24例，女 14例，年龄45～67岁，平均年龄（56.02±5.41）岁，糖尿病病程 3～11 年，平均（6.98±1.51）年，下肢骨折25例，髋骨骨折13例；研究组38例患者，男 22 例，女 16 例，年龄 47～63 岁，平均年龄（55.41±5.23）岁，糖尿病病程 2～13 年，平均（7.56±2.14）年，下肢骨折27例，髋骨骨折12例。对比两组患者性别、年龄及糖尿病病程一般资料后差异无统计学意义（P＞0.05），两组护理结果具有可比性。

诱导分化后的鼻粘膜类器官PAS染色呈阳性结果，染色部位主要位于鼻粘膜类器官中的杯状细胞（图8）。

关于“霍李比武”的事，具体发生在何时已经不可靠了，只知道肯定是在1900-1909年之间。在金恩钟先生所著的《国术名人录》一书中有关于霍元甲与李瑞东比武的描述：

类器官培养基主要细胞因子：R-Sponding1、Noggin、不 含Vit A 的B27、A83-01、SB202190（peprotech）、N-acetylcysteine、Nicotinamide（sigma）等；分化培养基：PneumaCult-ALI medium(STEMCELL)。

1.9 扫描及透射电镜观察

将两组培养21 d的人鼻粘膜类器官连同Transwell支持膜一同切下并用2.5%的戊二醛固定，由南方医科大学中心实验室电镜室常规制作电镜标本，JEOL JSM石000F型扫描电镜下拍摄照片，观察细胞形态及分化情况。

1.10 过碘酸雪夫（PAS）染色

ALI培养第21天，扫描电镜可见鼻粘膜类器官细胞表面覆盖微绒毛或纤毛，细胞间紧密连接，透射电镜可见微绒毛或纤毛的超微结构。DO组观察到纤毛上皮细胞分化良好，成簇状分布，鼻粘膜类器官具有纤毛功能（图5A、B）；EO组观察到纤毛上皮细胞分化程度低下，表面以微绒毛分布居多（图5C、D）。将EO组与DO组培养第21天的鼻粘膜类器官分别制成石蜡切片后，免疫组化染色显示，相比EO组，DO组类器官纤毛细胞数［(7.95±1.81)%(27.04±5.91)%，＜0.05］及杯状细胞数［(14.46±0.93)%(39.85±5.43)%，＜0.05）］占比更大，基底细胞占比无明显差异［(56.91±14.12)%(53.42±15.77)%，＞0.05，图6、7）］。

1.11 统计学方法

在EO组、DO组各选取至少3个样本中任意100个类器官记录其在培养第7天及第16天的空泡类器官数。培养第7天，两组大多为“实心”细胞团，DO组与EO组类器官空泡数差异无统计学意义（＞0.05）；培养第16天，DO组大多为“空心”细胞团（类器官空泡数为54.67±13.26），EO组大多为“实心”细胞团（类器官空泡数为21.67±8.57），DO组空泡数比例大于EO组，两组差异具有统计学意义（＜0.05，图3）。

2 结果

2.1 光镜下鼻粘膜类器官的生长形态变化

EO组：光镜连续拍照可见在整个干性培养过程中，鼻粘膜类器官一直处于“低分化”干性增殖状态（图1）。起初鼻粘膜类器官中空结构逐渐减小，上皮细胞不断扩增，形成边缘清晰且致密的细胞团后直径逐渐增大。选取至少3个样本中任意60个类器官记录，其在培养第16天的直径（176.97±10.14 μm）为第7天（80.40±17.54 μm）的2倍左右。

DO组：光镜连续拍照可见鼻粘膜类器官近似呈圆球形（图2），在整个培养过程中直径不断增大，选取同上相应样本中任意60个类器官记录，其在培养第16天的直径（138.05±10.00 μm）为第7天（77.47±16.09 μm）的1.5倍左右。7 d干性培养期内，起初成活的上皮细胞不断扩增生长形成边缘清晰的致密细胞团。分化培养初期，内部渐呈现类似腺腔的中空结构。随着培养时间的推移，分化程度增加，细胞极性增加。类器官中空结构不断增大，伴有细胞分泌或坏死物质，逐渐形成排列规则的环状壁,内缘出现类似刷状缘结构（图2）。

全部埋入型孤石的受力情况如图10所示，计算基本假定与部分出露孤石相同，仅多假设了边坡整体失稳前，孤石B在周围土体内部无旋转性。

比较EO组、DO组培养第7天、第16天类器官空泡数比例，以及培养第21天两组间类器官中所包含的各细胞类群比例。使用SPSS26.0 软件及GraphPad Prism 8进行统计分析，定量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本检验。＜0.05为差异具有统计学意义。

国务院扶贫办、中国人民银行等部门有关负责同志在论坛上发言。全国脱贫攻坚奖获奖者代表，以及中国热带农业科学院、湖南省永顺县等有关负责人介绍了产业扶贫的经验做法。

2.2 人鼻粘膜类器官来源性检测

将人鼻粘膜类器官与其来源组织同时进行STR检测，结果显示：来源组织细胞中无三等位基因或四等位基因，未发现受到其他人类细胞系污染；衍生的鼻粘膜类器官中无三等位基因或四等位基因，未发现受到其他人类细胞系污染。鼻粘膜类器官的等位基因与来源组织细胞的等位基因匹配度EV为100%（图4，表1）。

2.3 体外3D培养的鼻粘膜类器官的鉴定及纤毛细胞、杯状细胞分化情况

鼻粘膜类器官石蜡切片烤片脱蜡后；PAS 滴染20 min；自来水冲洗10 min；Schiff氏液10 min；流水冲洗5 min；苏木素染核8 min（细胞核染色过深可用盐酸酒精分化）；流水冲洗5 min；常规脱水、透明、封固。

式中，Yit=(LNLCCCit,LNPgdpit,LNLIIVit)T表示第i个城市第t年的3×1维内生变量，即土地综合承载力变量、人均GDP变量、地均第二、第三产业增加值变量。其中，i表示城市；j表示滞后期数；t表示年份。Yi,t-j表示滞后j期的变量；α0表示截距项;αj表示滞后期系数矩阵;φi表示固定效应向量;φit表示时间效应向量;γit表示随机误差向量。

2.4 人鼻粘膜类器官分泌功能的鉴定

定性结果判定：凡是在鼻粘膜细胞质、胞核和胞膜内出现棕褐色颗粒均判定为阳性；半定量结果判定：所有切片采用盲法由2名高年资病理科医师进行独立判定。镜下观察，出现棕褐色染色即判定为阳性结果，镜下随机选择切片中5个高倍视野（×400），每个视野统计150细胞，分别计算β-tubulin、MUC5AC、p63染色阳性的细胞比例，近似为该细胞类群所占比例，至少完成3个生物样本实验后进行统计学分析。染色阳性的细胞比例≤25%为弱阳性，26%～50%为阳性，≥51%为强阳性。

2.5 不同取材部位组织衍生的鼻腔呼吸区粘膜类器官的对比

鼻息肉、中鼻甲衍生的鼻腔呼吸区粘膜类器官经光镜及HE染色观察均为空泡状细胞团（图9），免疫组化染色结果显示均包含基底细胞（P63）、杯状细胞（MUC5AC）、纤毛细胞（β-tubulin）等主要细胞组成成分（图10），培养结果差异不大，考虑到伦理和样本来源的广泛性的问题，本研究大多采用鼻息肉组织进行培养。

3 讨论

本研究成功地诱导了鼻粘膜类器官的分化，并开发了分化程度可控的形态和功能上高度模拟人类鼻粘膜上皮的鼻粘膜类器官模型。既往研究中，鼻粘膜体外模型主要分为2D原代细胞模型、肿瘤细胞系及器官外植体模型。尽管2D永生化细胞系可以用作体外研究呼吸道的模型，但它们无法分化成由极化纤毛和产生粘液的细胞共同组成的异质细胞群，与原代细胞相比，这些细胞系表现出遗传和表型差异，无法模拟体内鼻粘膜的生理结构及功能，从而限制了其适用性；器官外植块培养技术尽管具有一定的组织结构和分化能力，但是由于缺乏标准化，培养过程中遗传变异和不可控的环境变量，导致器官型外植体模型的可重复性不高。现有的原代细胞培养模型可传代次数少的限制，需要从供体中重复收集组织，这可能会由于样本收集中的遗传差异或时间差异而引入生物变异性。

丰收的季节，田野的风光如画，田边小径将金色稻田分割成不同色块，小镇如同在油画中一般。在低处，看熟透的稻穗，看到的是丰收的喜悦；在高处，看漫山翠绿、稻田金黄、洁白的房屋迎着朝阳，看到的是希望。

与在二维环境中培养的常规原代细胞模型不同，类器官是由干细胞和分化细胞组成的自组织3D 细胞模型，其相对应的“干性和功能性”，能够很好地弥补以上不足。类器官来源于组织中具有分化潜能的干细胞，当细胞处于早期发育阶段，总体偏“幼稚”，与分化成熟的来源组织相比差异较大，这是制约类器官模型的一个重要缺陷。本研究围绕干细胞增殖与分化这一矛盾，在国内首次采用“扩增-分化”分段式培养法，成功建立了一种基于ALI的鼻粘膜类器官诱导分化模型。该技术体系稳定性高、可操作性强，大多类器官已连续培养1月以上仍保持良好的生物学特性。

近些年研究发现，呼吸道气管粘膜上皮基底细胞可能具有干细胞的功能，这些干细胞能分化成其他粘膜上皮细胞，比如杯状细胞、柱状纤毛细胞和柱状非纤毛细胞。研究结果提示，单个气管上皮基底细胞在培养基中可以分化成整个粘膜上皮层，在前人研究的基础上进一步说明呼吸道基底细胞具有干细胞或始祖细胞的特点：自我更新和分化的功能。随着研究深入，有学者报道鼻腔呼吸上皮基底细胞可能同样具有干细胞/始祖细胞的功能。有研究揭示了鼻腔呼吸上皮基底细胞具有分化成纤毛细胞的能力。本研究中EO组鼻粘膜类器官呈现一个由“空心球”转变为“实心球”的过程，其根本在于所使用的类器官培养基为干性培养基，其所含细胞因子主要作用为促进干细胞细胞增殖以及存活而不进入分化。鼻粘膜组织经消化后收集得到的细胞既包含假复层柱状上皮层的纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞也包含固有层的血管内皮细胞和腺体细胞，因此在培养第1天，可在镜下观察到实心球和空泡状的腺腔样结构。EO组鼻粘膜细胞在类器官培养基的作用下干性不断增强，细胞不断增殖，逐渐填满中空结构，直径逐渐增大。由于两组类器官均使用了气液界面这一特殊培养体系，因此，EO组类器官也会有低程度的细胞分化，在免疫组化染色中能够看到少量分化的纤毛细胞和杯状细胞。反之，DO组鼻粘膜类器官呈现一个由“实心球”转变为“空心球”的过程，则是因为前期（类器官培养基使用期）细胞不断增殖，直径逐渐增大，后期（分化培养基使用期）细胞分化及细胞极化程度不断增强，类器官逐渐形成细胞排列有序且具有纤毛功能和分泌功能的细胞团。本研究发现DO组中纤毛细胞及杯状细胞比例均明显高于EO组，基底细胞比例没有明显差别，说明“扩增-分化”分段式培养出的类器官能够维持良好的干细胞分化能力，同时分化程度更高，功能更加完善。有文献研究的肺类器官“干性-分化”培养组纤毛细胞比例明显高于“干性”培养组，差异有统计学意义，MUC5AC表达高于“干性”培养组，但差异无统计学意义。本研究与该研究结果趋势基本一致。

除了鼻粘膜类器官的结构，还需对其功能进行鉴定。在光镜下可观察到胶滴中DO组鼻粘膜类器官在纤毛的摆动作用下围绕着一个方向持续旋转，在扫描和透射电镜中观察到，DO组具有明显的纤毛结构。这表明“扩增-分化”分段式培养的鼻粘膜类器官具有近似于鼻粘膜组织中的纤毛柱状上皮细胞纤毛摆动的功能，通过PAS糖原染色证明“扩增-分化”分段式培养的鼻粘膜类器官具有近似于鼻粘膜组织中的杯状细胞的分泌功能。

考虑到伦理和样本来源广泛性的问题，本研究最先采用样本来源最为广泛的鼻内镜手术新鲜组织进行鼻粘膜类器官培养。其中，鼻息肉手术剩余组织标本在临床上多见，而中鼻甲、下鼻甲等鼻粘膜来源的手术标本较少见；此外，无论息肉还是正常鼻粘膜组织，所包含的基底细胞多向分化、自我更新和自组织潜能并未遭受破坏。在体外去除炎性因子及减弱感染性因素等微环境影响的干细胞培养体系内，通过wnt/β-catenin信号通路激活以及培养基各种细胞因子的协同调控，基底细胞将经历重新分化过程，自我组装形成具有类似鼻粘膜组织结构的3D细胞产物。本研究发现从鼻息肉取材经诱导分化培养的类器官与中鼻甲取材的相对正常的粘膜组织培养出的鼻粘膜类器官相比，两者鉴定结果差别不大，均包含鼻粘膜上皮中几种主要细胞类型如基底细胞、杯状细胞、纤毛细胞。于是，本研究大多以鼻息肉组织作为样本来源进行培养。

综上所述，本研究对人鼻粘膜类器官从病理学、分子生物学等不同层面进行鉴定，证明其具有近似于鼻粘膜组织结构及功能，并且“扩增-分化”分段式培养的鼻粘膜类器官成熟度更高。为人鼻粘膜类器官模型后续用于鼻粘膜纤毛功能、分泌功能，损伤修复机制，干细胞激活，肿瘤发生等机制及上呼吸道相关疾病的研究提供了可靠的实验依据。